Живильні мікробіологічні середовища
Необхідність культивування мікробів пов'язана не тільки з метою виділення збудника хвороби з досліджуваного матеріалу і визначення його виду, але і для накопичення мікробної маси при виготовленні біологічних препаратів: вакцин, антигенів і алергенів. Для культивування мікроорганізмів в лабораторних умовах застосовують різні штучні поживні середовища.
Живильні середовища бувають: по консистенції - рідкі, щільні, напіврідкі; за походженням - тварини, рослинного походження і синтетичні середовища постійного складу; за призначенням - звичайні, або прості, для вирощування більшості мікроорганізмів; спеціальні - для культивування мікробів, які не ростуть або погано ростуть на звичайних поживних середовищах; диференційно-діагностичні - вживаються для визначення родових або видових особливостей досліджуваних бактеріальних культур (гемолітичних, сахаролитических, протеолітичних, редукуючих і інших властивостей); селективні - для виділення мікробів одного роду або виду з матеріалу, що містить суміш різних видів мікроорганізмів, на яких одні види добре ростуть, а інші не ростуть; середовища збагачення (накопичувальні).
Основою багатьох поживних середовищ тваринного походження є м'ясна вода. Її готують зі свіжого нежирного яловичого м'яса, звільненого від кісток, фасцій, сухожиль. Подрібнене м'ясо (дрібні шматочки або фарш) заливають дистильованою водою у співвідношенні 1 2 (на 1 кг м'яса 2 л води). Екстрагують 12-24 год, кип'ятять 1,5- 2 год, фільтрують, додають дистильованої води до початкового об'єму, розливають в пляшки, колби, закривають ватно-марлевими пробками і стерилізують в автоклаві.
Звичайні (прості) середовища.
М'ясо-пептони бульйон (МПБ) - рідка живильне середовище. Для його приготування до 1 л м'ясної води додають 1% пептона, 0,5% хімічно чистої кухонної солі і кип'ятять. М'ясна вода слабокислою реакції, тому МПБ подщелачивают - додають невелику кількість 10- 15% -ного раствораКОН або NaOH, кип'ятять 2-3 хв, перевіряють рН за допомогою компаратора Міхаелнса (рис. 30) або електропотенціометром. М'ясо-пептони бульйон фільтрують через паперовий фільтр, розливають по пробірках, автоклавують.
М'ясо-пептони агар (МПА) - щільна живильне середовище. До МПБ додають 2% агар-агар (без-азотистих органічна речовина, отримане з морських водоростей) і кип'ятять до його розплавлення, в гарячому вигляді встановлюють рН, кип'ятять 5-10 хв, фільтрують в гарячому вигляді через ватно-марлевий фільтр, розливають в пробірки або колбочки, автоклавують. Після стерилізації гарячі пробірки з агаром розкладають похило під кутом 5-6 °. При застиганні утворюється скошена щільна поверхня.
М'ясо-пептони напіврідкий агар готують так само, як і МПА; відмінність полягає в тому, що агар-агар додають менше - 0,15-0,20-0,25%.
Спеціальні поживні середовища.
Бульйон Хоттингера готують з триптичного гідролізату (переварити) м'ясних відходів - фасцій, жиру, сухожиль. 1 кг м'ясних обрізків заливають 2 л окропу, кип'ятять 5 хв, охолоджують до 45 ° і додають 5,0-10,0 панкреатину, подщелачивают до рН 7,8-8,0 вуглекислим натрієм, струшують і доливають хлороформ (10 мл на 1 л), щільно закривають, витримують в теплому місці 10 днів, щодня струшуючи. Отриманий перевар підкисляють соляною кислотою до рН 5,5. Зберігають в темному місці. Для приготування живильного середовища до 1 л води додають 100-200 мл отриманого переварити, кип'ятять 1-2 хв, фільтрують, подщелачивают, стерилізують. Агар Хоттингера готують так само, як і звичайний МПА.
Цукровий (глюкозний) бульйон (або агар) виготовляють як звичайні середовища, але до них додають 1-2% глюкози і стерилізують текучою парою або автоклавують при 0,5 атм.
М'ясо-пептонна желатину. До МПБ додають 10-20% желатини (продукт, одержуваний з клейдающіх тканин тварин), розплавляють і в гарячому вигляді встановлюють потрібну реакцію середовища, пропускають через ватно-марлевий фільтр, розливають в пробірки, стерилізують текучою парою дрібно.
М'ясо-пептони печінковий бульйон Кітт - Тароцці - рідке середовище для культивування анаеробів. Печінка великої рогатої худоби нарізають дрібними шматочками, заливають водою 1: 1, кип'ятять, фільтрують і печінкову воду додають до МПБ 2. 1 (на 2 л МПБ 1 л печінкового відвару), кип'ятять, встановлюють рН, розливають по пробірках високим стовпчиком, в які попередньо покладені шматочки вареної печінки. У пробірки поверх середовища наливають 1-2 мл вазелінового масла і стерилізують в автоклаві при 0,5 атм 30 хв. ^
Сироватковий бульйон і сироватковий м'ясо-пептони агар готують шляхом асептичного додавання до МПБ або розплавленому н охолодженого до 45-50 ° МПА 5-10% стерильної сироватки крові коня (або барана, кролика), потім сироватковий бульйон розливають в стерильні пробірки (колби ).
Сироватковий МПА розливають або в пробірки (стовпчиком). або в чашки Петрі.
Диференційно-діагностичні середовища. Кров'яний МПА застосовують для виявлення гемолітичних властивостей бактерій. Попередньо в стерильну колбу зі скляними бусами асептично беруть кров (у барана, коня або кролика), струшують 15-20 хв, щоб фібрин відокремити від решти маси крові. Фібрин згустками осідає на намисті і Дефібриновану кров (5-10%) стерильно додають до розплавленого і охолоджені МПА, легким обертанням колбочки рівномірно змішують і розливають в стерильні чашки Петрі.
Середовища Гіссен. У пептонную воду (що складається з дистильованої води, 0,5% NaCl і 1% пептона) додають 0,5% вуглеводу (цукор або багатоатомний спирт) і 0,5% індикатора Андреде. Зазвичай готують набір середовищ з різними вуглеводами, кожен окремо. Використовуваний індикатор являє собою 0,5 г кислого фуксину, 16 мл 4% -ного розчину NaOH, 100 мл дистильованої води. Середовища з вуглеводами розливають в пробірки з «газовка» (поплавками), опущеними в пробірки догори дном. Стерилізують середовища з вуглеводами текучим паром дрібно. Середовища Гіссен можуть бути рідкі та полужідкіе- (без газовок), що містять 0,25% агару. При ферментації того чи _іного вуглеводу мікробом, зростаючим в даному середовищі, утворюється кислота, під дією якої відновлюється колір фарби індикатора. Середа набуває червоного кольору. Утворилися прн ферментації вуглеводу газоподібні продукти накопичуються в поплавцях.
Середовище Ендо. У розплавлений МПА (рН 7,4- 7,6) вносять 0,5-1% лактози і 0,5% насиченого спиртового розчину основного фуксину, знебарвленого додаванням по краплях 10% -ного сірчанокислого натрію. Середу кип'ятять і розливають в чашки Петрі. Бактерії, зброджують лактозу, на цьому середовищі ростуть у вигляді червоних колоній.
Середа Левіна. Готують 2% -ний агар на бульйоні Хоттингера, рН 7,2-7,4, стерилізують в автоклаві. До 100 мл готового розплавленого агару додають: 2 мл 0,5% -ного розчину метиленової синьки, 1,5 мл 2% -ного еозину (лужного бактеріологічного), 2 г лактози і 0,2 г двуосновних фосфорнокислого калію (КаНРО4). Розчини барвників готують на дистильованої воді і стерилізують в апараті Коха. Розчин метиленової синьки перед вживанням підігрівають на водяній бані і додають до агару в теплому вигляді. Після додавання цих компонентів середу ретельно перемішують і розливають у чашки Петрі. Середа фіолетового кольору.
Вісмут-сульфіт агар (середа Вільсон- Блера). МПА (рН 7,5) з індикатором, що містить лимонно-кислий вісмут, сірчанокислий натрій, сіль Мора (серноаммонійная сіль заліза), двоосновний фосфат натрій, глюкозу і діамантову зелень. В даний час вісмут-сульфіт агар (як і агар Ендо, середу Плоскірєва) промисловість випускає в сухому порошкоподібному вигляді. 6 г сухого порошку розчиняють в 100 мл дистильованої води, підігрівають при безперервному помішуванні, розливають в стерильні пробірки і залишають в похилому положенні. Застосовують також середовища з хімічними речовинами, які змінюють забарвлення в результаті окисно-відновних (редукуючих) процесів, обумовлених ферментами бактерій. Для цього готують молоко з метиленової сі нько й. Свіже знежирене коров'яче молоко подщелачивают двовуглекислим натром до слаболужної реакції за лакмусовим папірцем, додають 1% -ний водний розчин метиленової синьки та блакитного забарвлення. Стерилізують текучим паром дрібно.
Якщо є припущення, що в досліджуваному матеріалі є невелика кількість бактерій, то рекомендують використовувати середовища накопичення (збагачення). З р од а Шустова: до МПА (рН 7,4) додають 10% 50% -ного водного розчину гіпосульфіту і 2% розчину Люголя. Застосовують для накопичення бактерій паратифу. Середа Раппопорт: до МПБ додають 1% глюкози, 10% жовчі і 1% індикатора Андреде. Стерилізують текучим паром.
Синтетичні середовища застосовують для вивчення метаболізму бактерій та інших біологічних особливостей. Їх складають з хімічно чистих розчинних у воді речовин, в строго певних кількостях: фосфорнокислого амонію, фосфорнокислого калію, хлористого натру, сірчанокислого магнію, глюкози або іншого вуглеводу, нікотинаміду та ін. У міру необхідності готують щільні синтетичні середовища шляхом додавання агару. Стерилізують в автоклаві. (Синтетичні середовища Моделя, Соттона
Для культивування дріжджів і цвілевих грибів використовують такі середовища
Синтетичному середовищі Ван-Ітерсона. азотнокислого амонію (NaH4NO3) 0,5, калію фосфорнокислого одноосновного (КН2РО4) 0,5, води водопровідної 1 л. Автоклавують при 1 атм 20 хв.
Глюкозний агар Сабуро: глюкози 4,0, пептона 1,0, агару 1,8, води 100 мл. Стерилізують автоклавіроваііем.
Агар Літмана з бичачої жовчю: пептона 10,0, глюкози 10,0 обезводненої бичачої жовчі 15 мл, крісталлвіолета 0,01, води 1 л, агару 20,0. Стерилізують в автоклаві при 1 атм 15 хв. Розливають у * чашки товстим шаром, щоб попередити зневоднення середовища.