Виділення і культивування вірусів
Виділення та ідентифікація збудника - «золотий стандарт» у діагностиці вірусних інфекцій.
Віруси розмножуються тільки в живих клітинах, і виділення збудника в зараженій культурі клітин - один з основних методів діагностики вірусних інфекцій. Оскільки більшість патогенних вірусів відрізняє тканинна і типова специфічність, то майже до кожного вірусу можна підібрати відповідні клітинні або тканинні культури, а також створити стандартні умови культивування (наявність клітин одного типу). Розмноження вірусу забезпечують чутливі (пермісивними) клітини. Тому при виділенні невідомого збудника проводять одномоментне зараження 3-4 культур клітин, припускаючи, що одна з них може виявитися пермісивними. Культури клітин отримують диспергированием відповідних органів і тканин, але частіше використовують ембріональні тканини (людини і тварин) або трансформовані пухлинні клітини. При приміщенні на відповідну плоску поверхню клітинні культури зазвичай ростуть у вигляді моношару.
Первинно-трипсінізірована культури. Суспензії клітин отримують гомогенізірованіем відповідних тканин, попередньо оброблених трипсином. Культури часто представлені клітинами змішаного типу і не підлягають повторному культивування. Життєздатність таких культур становить 2-3 тижнів.
Полуперевіваемие лінії клітин представлені диплоїдними клітинами людини і тварин. Культури обмежено придатні до повторного диспергированию і зростання (як правило, не більше 20-30 пересівань), зберігаючи при цьому життєздатність і не піддаючись спонтанної трансформації.
Перещеплюваних лінії клітин (гетероплоідние культури) представлені клітинами, підданими тривалого культивування і спонтанним трансформаціям. Культури здатні до багаторазового диспергированию і перевіванію. Робота з ними менш трудомістка в порівнянні з приготуваннями первинних культур; перещеплюваних клітини щодо однакові по своїй морфології і стабільні за властивостями.
Не всі види клітин здатні рости у вигляді моношару, в деяких випадках підтримка диференційованих клітин можливо тільки в культурі органу. Зазвичай це суспензія тканини, яка має спеціалізованої функцією, також позначається як культура переживає тканини.
Курячі ембріони - практично ідеальні моделі для культивування деяких вірусів (наприклад, грипу і кору). Замкнута порожнина ембріона перешкоджає проникненню мікроорганізмів ззовні, а також розвитку спонтанних вірусних інфекцій. Ембріони застосовують для первинного виділення вірусів з патологічного матеріалу; для пассірованія і збереження їх, а також для отримання необхідних кількостей вірусу. Деякі збудники (наприклад, герпесвіруси) викликають характерні зміни (по ним можна розпізнавати захворювання). Зараження проводять на хоріон-аллантоісную оболонку, в амніотичну або аллантоісную порожнину або в жовтковий мішок.
Зараження на хоріон-аллантоісную мембрану. Зазвичай використовують 10-12-добові ембріони. Яйця переглядають в світлі, відзначають локалізацію повітряного мішка і вибирають область без судин. Обережно видаляють фрагмент шкаралупи, звільняють зовнішню оболонку і отслаивают її обережним натисканням. Потім роблять отвір у краю повітряного мішка. При відсмоктуванні через цей отвір хоріон-аллантоісная оболонка відшаровується від зовнішньої оболонки. На неї наносять досліджуваний матеріал, вільний від бактерій і найпростіших (пропущений через бактеріальні фільтри і оброблений бактерицидами).
Зараження в амніотичну порожнину. Зазвичай використовують 7-14-добові ембріони, у яких після відшарування хоріон-аллантоісной оболонки (див. Вище) розширюють отвір, захоплюють пінцетом амніотичну оболонку і виводять через хоріон-аллантоісную оболонку. Через неї в амніотичну порожнину вводять досліджуваний матеріал.
Зараження в аллантоісную по лость. 10-добові ембріони заражають через отвори, зроблені в шкаралупі і підлягають оболонках (див. Вище).
Зараження в жовтковий мішок. використовують 3
8-добові ембріони, у яких в цьому віці жовтковий мішок займає майже всю порожнину яйця. Зараження проводять через отвір, зроблений в повітряному мішку
Спостереження і облік результатів. Як віруссодержащего матеріалу можна використовувати вміст жовткового мішка, аллантоісную і амніотичну рідини або весь ембріон, нарізаний разом з навколишніми тканинами на шматочки. Для виявлення характерних поразок на хоріон- розвивається курячого ембріона.
аллантоісной мембрані видаляють шкаралупу і зовнішню оболонку. Потім мембрану витягують і поміщають в стерильну воду. Характер уражень вивчають на темному тлі.
При неможливості виділити та ідентифікувати вірус стандартними методами in vitro інфекційний матеріал вводять чутливим до збудника тваринам, і після розвитку типового інфекційного процесу проводять повторне зараження чутливих клітинних культур. Найбільш часто використовують мишей, кроликів і мавп; для виділення деяких вірусів (наприклад, вірусів Коксакі) заражають мишенят-шмаркачів. Внаслідок дорожнечі і складності змісту лабораторних тварин, практично повсюдно їх витіснили клітинні культури. Проте, тварини моделі активно використовують для вивчення особливостей патогенезу та формування імунних реакцій при вірусних інфекціях.
Наявність і біологічну активність вірусів визначають по ефектах, які спостерігаються на тваринних моделях (підвищення температури тіла, поява характерних клінічних ознак, загибель і т.д.), курячих ембріонах і на клітинах (в культурах). Під впливом конкретних вірусів можлива зміна морфології, росту, репродукції клітин або їх руйнування. Факт розмноження вірусів в чутливих клітинах in vitro визначають по цитопатическим ефектів (в тому числі бляшкоутворення, тільцям включень), феномену гемадсорбції, «кольорової реакції».
Цитопатична ефекти оцінюють при мікроскопії клітинних культур. За ступенем ураження клітин виділяють віруси з високою або помірною Цитопатогенні. Розмноження вірусів в культурах клітин супроводжується порушеннями морфології клітин моношару. Деякі віруси викликають характерні цитопатична зміни, що (з урахуванням клінічної картини захворювання) дозволяє швидко поставити попередній діагноз. Наприклад, розмноження параміксовірусів (віруси кору, паротиту, PC-вірус) супроводжується появою характерних гігантських багатоядерних клітин; аденовіруси викликають утворення скупчень великих круглих клітин, а при репродукції герпесвірусів клітини округлої форми дифузно розташовуються по всьому моношар.
Бляшкоутворення. «Бляшки» називають негативні колонії - ділянки зруйнованих клітин, що виглядають як зони просвітління на монослоях клітин, покритих шаром агару. У деяких випадках дозу і Цитопатогенні вірусу висловлюють в бляшкообразующіх одиницях (БОЮ).
Тельця включень. Багато віруси викликають появу в заражених клітинах характерних утворень - скупчень вірусних білків або частинок, видимих в світловий мікроскоп. Тельця включень можуть розташовуватися як в цитоплазмі (тільця Гварнері при віспі), так і в ядрах клітин (аденовіруси).
Відсутність цитопатичної ефекту. Деякі віруси (наприклад, вірус краснухи) не виявляють цитопатического ефекту. Їх можна виявляти по інтерференції іншого вірусу, здатного викликати дегенерацію заражених клітин.
Феномен гемадсорбції. Багато заражені вірусами клітини набувають здатність сорбувати на своїй поверхні різні еритроцити. Феномен гемадсорбції має загальні механізми з гемаглютинації і проявляється на ранніх термінах, до прояву цитопатичної ефекту, при його відсутності або слабкої вираженості.
«Кольорова реакція». У культуральне середовище, використовувану для підтримки клітин, вносять індикатор. Зростання клітин супроводжується накопиченням метаболітів, зрушенням рН середовища і зміною забарвлення індикатора. Зараження культур вірусом різко пригнічує клітинний метаболізм, і середовище зберігає первісний колір.
Експрес-діагностика. Для швидкої ідентифікації вірусної інфекції розроблені численні методи експрес-діагностики, засновані на виявленні вірусних Аг. Наприклад, для ранньої діагностики ВІЛ-інфекції широко використовують ІФА, що виявляє поверхневі Ar вірусу.