Секвенування генома людини
Мал. 4.9. Дезоксітімідінтріфосфат (дТТФ) і дідезоксітімідінтріфосфат (ддТТФ)
ня, вона вже не зв'язується з іншим нуклеотидним підставою (в позиції 5 '), і ланцюг ДНК обривається в цьому місці. Те ж відбувається з іншими підставами ДНК (аденін, гуаніном і цитозином). У підсумку можна отримувати ДНК різної довжини (на зображеннях молекул порожні кути на кільцях відповідають атомам вуглецю).
Сенгеровскій метод обриву ланцюга дідезоксіднимі підставами для секвенування ДНК починається з того, що за допомогою рестрикційних ферментів розщеплюють подвергаемую секвенированию ДНК на менші ділянки, а ДНК нагрівають до повного поділу обох її ниток. Потім до цих однонітевую ділянок ДНК додають трифосфати з дідезоксідним підставою, після чого вводиться білковий фермент ДНК полімераза, який приступає до
збірці копій вихідної ДНК. Через дідезоксідних підстав зібрані молекули являють собою не копії вихідної ДНК, а суміш з отриманих перш ділянок ДНК. Попередньо дідезоксідние підстави позначаються (маркуються) або радіоактивним ізотопом фосфору, або чутливим до ультрафіолетового світла барвником, так що кінець кожної обірваної ланцюга стає видимим.
Даний метод широко застосовувався до середини 1980-х років, і робота над дисертацією у багатьох аспірантів закінчувалися участю в багаторічному проект з секвенування певної частини ДНК одного з модельних організмів. Доводилося брати проби у організму, очищати, змішувати з хімічними реактивами, вирощувати, поміщати в гель і проводити дослідження, після чого збирати і тлумачити дані. Робота була важкою і просувалася повільно. Зазвичай в ході написання дисертації вдавалося вибудувати ділянку в 40 тис. Парних підстав ДНК.
* «Джела» (Jell-O) - напівфабрикати желе і мусів, що випускаються у вигляді порошку найбільшим в США виробником харчових продуктів Kraft Foods Inc. дочірньою компанією Philip Morris Cos.
Інші висловили заклопотаність, що подібний гігантський проект спотворить біологію до невпізнання. Розшифровка 3 млрд пар азотистих основ за допомогою наявних на той час засобів потребують 15-річної безперервної роботи 10 тис. Аспірантів і обійдеться приблизно в 3 млрд доларів. При таких витратах людських і грошових ресурсів нічого не залишиться на всі інші біологічні проекти.
лабораторіям і університетам в США, і близько третини припадало на частку Великобританії, Франції, Німеччини та Японії.
спадкові захворювання. Незважаючи на відмінну роботу самих пристроїв, гени, пошуком яких займався Вентер, знайдені не були. До того ж програмне забезпечення виявило значне число помилкових результатів, так що багато чого довелося звіряти вручну.
Вентеру надто вже кортіло перегорнути довгі послідовності з генетичних букв в пошуках небагатьох потрібних генів або ділянок геному, де закодовані білки. І його осінило, як наростити зусилля. Щоб відшукати активні гени в певній клітці, він спочатку видобував із клітини РНК. Раз РНК будується перш за все на основі ДНК, вона містить послідовність парних підстав нуклеотидів, що відноситься до активних частинах (генам) вихідної ДНК. Потім дослідники перетворювали РНК в більш стійку ДНК (іменовану компліментарної ДНК - кДНК) і для зберігання приєднували її до хромосомі який-небудь бактерії, використовуючи прийом різання і склеювання за допомогою рестрикційних ферментів. Компліментарної ДНК користуються в біологічних лабораторіях по всьому світу, так що недоліку в ній немає. Наступний крок пов'язаний з секвенуванням кДНК і порівнянням її з іншими секвенований генами. Даний підхід, названий експресуються ярликами *. був не новий для Вентера. Про нього вперше написав хімік-біолог Пол
В даному випадку можуть виходити не повні послідовності генів, а тільки окремі їх ділянки (як би
Шіммель в 1983 році, а відомий генетик Сідні Бреннер і інші вчені широко використовували в кінці 1980-х. Але завдяки ABI Sequencer і електронно-обчислювальних робочих станцій за можливостями секвенування лабораторії Вентера не було рівних.
«Ярлички», марковані ці гени), які заносять в банк даних і за якими в подальшому можна ідентифікувати цю послідовність, якщо вона буде виділена з інших джерел. Звідси цей метод отримав назву «експресуються ярлики послідовностей» - Expressed Sequence Tags (ESTs).
загроза патентування
фірми Sun, оснащеної відповідними програмними засобами бази даних, Вентер почав нарощувати секвенування на основі «експрессіруемих ярликів» послідовності генів у модельних організмів. При вартості одного пристрою 100 тис. Доларів для фінансування такого підприємства потрібні були товстосуми.
Фінансування забезпечив наплив в біологію підприємців. Уолліс Стайнберг, глава компанії Health Care Investition Corporation, і винахідник зубної щітки Річ вклали в проект 70 млн доларів. Таким чином, Вентер міг спокійно втілювати в життя свої ідеї. Була створена як дочірнє підприємство компанія Human Genome Sciences (HGS) для комерційного використання результатів досліджень генома людини. Вентер був задоволений і заявив: «Кожен вчений мріє про благодійника, які погодилися вкласти кошти в його ідеї, сподівання і здібності». Єдина умова - надання отриманих даних в розпорядження компанії на 6-12 місяців, перш ніж їх можна буде оприлюднити. Його наукові колеги захоплювалися значно менше. Деякі навіть охрестили його Дартом Вентером [натякаючи на Дарта Вейдера з фільму «Зоряні війни», лицаря, переметнувся на бік зла].
Тим часом НИЗ призначив нового керівника Центру з дослідження геному людини. Відомий генетик з Мічі-
секвенування дробленням
Коли міжнародний консорціум намагався прискорити свою роботу, лабораторія Вентера TIGR вирішила вдатися до нової тактики: секвенированию дробленням. Співробітник Університету Джонса Хопкінса і Нобелівський лауреат Гамілтон Сміт, який відкрив 20 років тому рестрикційні ферменти (рестріктази), висунув разючу ідею: спочатку ультразвуком посікти ДНК на тисячі шматочків довільної величини, а потім на пристроях-роботах ABI зробити окремо секвенування всіх шматочків. Закласти отримані дані в ЕОМ, і нехай спеціальні програми відшукують перекриваються ділянки, щоб тим самим можна було «зшити» математично шматочки, створюючи одну безперервну ДНК. Даний прийом виявився результативним при моделюванні, і Вентер не побоявся ризикнути. TIGR розшифрувала весь геном бактерії Haemophilus influenzae за 13 місяців, витративши в два рази менше коштів порівняно з проектом генома людини. Незабаром TIGR завершила складання послідовності нуклеотидів Mycoplasma genitalium, найменшого з відомих самостійних живих організмів, а також генома декількох архей. Після доведення до відома широкого користування сво-
їх цінних відомостей Вентер виріс в очах своїх вчених побратимів.
Вентер любив відчувати себе. Після переговорів, більше нагадували застереження, з керівником проекту генома людини Коллинзом Вентер оголосив про створення нової компанії і її головної мети: розшифровці всього генома людини всього за три роки, що істотно випереджало терміни проекту генома людини. Його нове дітище но
сило назву «Силер» (від лат. ceteris- швидкий) .Девізом компанії стали слова «Поспішай, відкриття не чекають».
Для дослідної перевірки Вентер провів секвенування улюбленого в біології модельного організму - Drosophila melanogaster, плодової мушки. Що складається з 165 млн пар нуклеотидних основ, 13 600 генів ДНК встановили менш ніж за чотири місяці, якраз вчасно, щоб записати її на диски CD-ROM, якими забезпечили всі місця на одному науковому нараді за день до виходу статті про геномі в журналі Science .
Міжнародний консорціум «Проект геному людини» не сидів склавши руки. З отриманням додаткових коштів, особливо від британського благодійного фонду Уеллкома (Wellcome Trust) *. вдалося обзавестися новими уст-
Ті, що змагаються боку часом вступали в переговори, але напруга в стосунках нагнітали кошти