Культивування ембріонів in vitro
Культивування ембріонів є важливим етапом процедури ЕКО. Від того, наскільки успішно він пройде, залежить подальша імплантація ембріона. Технології культивації постійно вдосконалюються, при цьому особлива увага приділяється живильних середовищ. Сучасні препарати максимально близькі за складом до природних умов материнського організму.
Що таке культивування ембріона?
Культивуванням ембріонів називають процес створення умов для запліднення яйцеклітини і її подальшого розвитку. Всі етапи відбуваються в лабораторних умовах: в спеціальному середовищі, що має склад практично такий же, як рідина в матці і фаллопієвих трубах.
Початок культивування ембріонів відбувається через добу після вилучення фолікулів з організму жінки. Ембріолог оцінює наступ запліднення і встановлює імовірну дату перенесення матеріалу в матку.
Тривале культивування ембріонів - одна з останніх розробок у цій галузі науки. Суть цієї процедури в тому, що вирощування триває протягом 5-ти діб до стадії бластоцист з високою здатністю до закріплення на стінці матки. Можливість досягти такого рівня розвитку з'явилася завдяки розробці спеціальних субстанцій, що імітують мікросередовища жіночого організму.
Живильні середовища для вирощування ембріонів розробляються з 1912 року. Спочатку вони представляли собою фізіологічний розчин солі. Понад століття склад цих субстанцій удосконалювався. У 1985 році ведення в них альбуміну - джерело амінокислот - стало серйозним проривом і дозволило вирощувати ембріони до 2-3 діб.
Це середовище отримала назву Human Tubal Fluid. Подальші дослідження показали, що розвиток заплідненої яйцеклітини відбувається не в одній і тій же субстанції, а в різних. Це призвело до створення двоступеневих середовищ, які використовуються в даний час.
Остання розробка, що поліпшує якість процедури - культивування ембріонів в середовищі ЕмбріоГен. Вона містить GM-CSF - гранулоцитарно-макрофагальний колонієстимулюючий фактор, який у великій концентрації присутній в матці до і під час прикріплення до стінки ембріона, а також протягом звий вагітності. У жінок з безпліддям він практично відсутній.
Середа ЕмбріоГен підвищує якість і життєздатність переноситься при ЕКЗ матеріалу, збільшує ймовірність успішної імплантації і подальшого виношування плоду. Вона незамінна для пацієнток, у яких вже були невдалі спроби штучного запліднення. і в тих випадках, коли вдається зробити забір всього однієї або двох яйцеклітин.
Культивування ембріонів починається на наступний день після пункції з забором яйцеклітин і їх запліднення. Вирощування проходить в кілька етапів:
- Етап зрілої яйцеклітини - 1-й день. Ембріолог оцінює успішність запліднення, відокремлює неякісний матеріал. Ця стадія пронуклеусов. Перенесення практично не практикується, але можна кріконсервіровать клітини.
- Етап заплідненої яйцеклітини з двома пронуклеуса - 2-й день. До цього часу утворюється зигота (злиття чоловічого і жіночого генома), відбувається перше дроблення. Яйцеклітина стає ембріоном. Оцінюється його якість за ступенем фрагментації, формою і розмірами бластомерів.
- Етап 4-клітинного ембріона - 3-й день. Найчастіше до цього часу ембріон є 6 або 8 бластомерів. Відбувається активація власного геному, від того наскільки вона успішна і своєчасна залежать подальші етапи культивування. Коли в наборі хромосом є помилки, розвиток зупиняється ( «блок розвитку in vitro»).
- Етап 8-клітинного ембріона - 4-й день. Початок стадії морули: простору між клітин ущільнюються, поверхня стає більш згладженої. Ембріон до цього часу складається з 10-16 бластоцист. До завершення 4-го дня в Морула з'являється порожнина - початок кавітації.
- Етап компактної морули - 5-й і 6-й день. Обсяг порожнини займає половину всієї морули - ембріон стає бластоцистой. Він складається з внутрішньої клітинної маси і трофобласта, який забезпечує імплантацію.
Переваги і недоліки кожного етапу культивування
У кожних добі культивування є позитивні і негативні моменти для перенесення ембріона в організм жінки:
- 1 добу. Переваги такого короткого терміну в тому, що потенційне шкідливий вплив умов культивування мінімально. Проблеми перенесення в матку пов'язані з тим, що фізіологічно в цей час ембріон повинен перебувати в фаллопієвій трубі (не в матці). До того ж, важко оцінити його якість.
- 2 добу. Плюси в тому, що ембріон недовго перебуває поза природного середовища і вже можна зробити первинний відбір якісних екземплярів, так як почалося дроблення. Мінуси: ще немає можливості відокремити ембріони з порушеннями генома, не можна провести Попередімплантаційна генетичну діагностику.
- 3 добу. Позитивний момент в тому, що можна відокремити ембріони, які відстають у розвитку або зовсім його припинили. Недоліки такі ж, як і на 2 добу.
- 4 добу. Позитивний момент цього терміну в тому, що ембріон досяг стадії, на якій відбувається його переміщення з фаллопиевой труби в матку, тобто введення його в порожнину буде близько до фізіологічного. Таке тривале культивування ембріонів «in vitro» сприяє подоланню «блоку розвитку» - зупинки дроблення «в пробірці (склі)». На цьому терміні вже можна виконати Попередімплантаційна генетичну діагностику (ПГД). Недолік: складно оцінити якість морул.
- 5 добу. На цьому терміні в 2 рази підвищується ймовірність імплантації бластоцист в порівнянні з дво- або триденними ембріонами. Стався відбір найбільш сильних і якісних екземплярів, ними пережитий «блок розвитку» «in vitro», можна виконати ПГД, оцінити якість бластоцист. Мінусом можна назвати те, що якщо все ембріони зупинилися на більш ранніх стадіях, пацієнтки відчувають сильний стрес, переживають втрату можливості завагітніти.
Побічні ефекти
При проведенні процедури ЕКЗ не все яйцеклітини стають ембріонами. Згідно зі статистикою, цей показник досягає в середньому 60-70% при стандартному заплідненні і 80-90% при інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїда в яйцеклітину.
До стадії бластоцисти, готової до пересадки в матку, розвивається близько 40% ембріонів. І це середні показники, на практиці зустрічаються випадки з більш низькою ймовірністю успіху.
Культивування ембріонів «in vitro» відбувається при постійній оцінці якості примірників ембріологом. Довгий час середовища для розвитку дозволяли вирощувати запліднену яйцеклітину не більше 3-х діб. Можна було отримати більшу кількість матеріалу, але не було можливості точно оцінити їх життєздатність.
З появою двоступеневих середовищ стало доступним тривалий культивування - до 5-6 діб. Стало простіше виявляти якісні екземпляри, але їх кількість зменшилася. З'явився ризик, що до 4-5 дня не залишиться жодного ембріона. При цьому неможливо встановити, що саме призвело до зупинки їхнього розвитку: неідеальні штучні умови вирощування або генетичні порушення.
Культивуванням ембріонів називають процес спостереження за їх розвитком, відбору найбільш життєздатних примірників і визначення найбільш сприятливого дня для їх перенесення в порожнину матки. Завдяки розвитку середовищ для вирощування ця процедура може тривати до 4-6 днів. До кінця цього терміну успішна імплантація ембріона найбільш імовірна в більшості клінічних випадків.