Секвенування простих геномів
Секвенування простих геномів
Для визначення нуклеотидної послідовності (т. Е. Первинної структури) конкретного району ДНК в першу чергу необхідно спростити її, що досягається шляхом розрізання її на відносно короткі фрагменти. Зробити це можна, наприклад, за допомогою спеціальних «скальпелів» для ДНК - ферментів рестриктаз, про які вже йшлося вище.
При секвенування найпростіших організмів, у яких геном відносно невеликий, зазвичай використовують процедуру, звану умовно «зверху вниз». Всю ДНК «розрізають» на шматочки за допомогою вже згадуваних вище ферментів рестриктаз, потім секвеніруют ці шматочки окремо, а після «склеюють» з них повний геном. «Склеювання» оригіналу здійснюється за рахунок того, що нуклеотидні послідовності різних шматочків перекриваються один з одним, т. Е. Однакові по кінцях. Ця методологія отримала назву «дробовика». Суть даної процедури відображена на рис. 16.
Мал. 16. Схема стратегії «дробовика», яка використовується для секвенування великих молекул ДНК
Однак в разі такого дуже складного генома, як геном людини, почали з іншого, а саме з визначення положення відомих генів і інших генетичних маркерів на окремих хромосомах, тобто з генетичного картування геному. Таке завдання генетичними експериментами на більш простих об'єктах намагався вирішити ще Т. Морган, який за свої роботи отримав Нобелівську премію в 1933 році. Тепер з'явилися більш ефективні методи. Один з них, званий методом «радіаційних гібридів», полягає в наступному. Клітини людини, що ростуть поза організмом в живильному середовищі, опромінюють рентгеном, що призводить до загибелі клітин в результаті розриву хромосомної ДНК на шматки, що містять від 2,5 до 25 млн. П. Н. Але перш, ніж убиті опроміненням клітини розпадуться, їх зливають з клітинами хом'яка, в результаті чого в різні клітини хом'ячка потрапляють різні набори фрагментів ДНК людини. Потім «гібридні» клітини розмножують в культурі, при цьому в них поряд з власною ДНК реплицируются і фрагменти чужорідної ДНК. Потім визначають склад відомих генів і інших генетичних маркерів в кожної клітинної лінії і, статистично обробивши отримані дані, виводять найбільш ймовірне їх взаємне розташування в хромосомах. Як генетичних маркерів використовували як гени, так і фрагменти ДНК з невідомою функцією. Для картування хромосом важливою властивістю маркерів був їх поліморфізм, т. Е. Існування різних форм серед індивідуумів.
Так були побудовані перші генетичні карти геному людини, на яких спочатку були відзначені різні генетичні маркери, віддалені один від одного на відстані не більше 2 мільйонів нуклеотидних пар (млн. Н. П.).
Потім були складені фізичні карти хромосом: спочатку з дозволом 0,1 млн. Н. п. а потім 0,001 млн. н. п. Для цієї мети на першому етапі застосовували методи фарбування хромосом і гібридизації з хромосомами in situ. І лише пізніше використовували рестріктази. За допомогою цих дивно точно працюють ферментів «дробили» ДНК за строго певних ділянок на мільйони перекриваються між собою по нуклеотидної послідовності фрагментів, «розбирали» кожен з них окремо, після чого з них «склеювали» оригінал. «Склеювання» проводили на підставі перекривання фрагментів по нуклеотидної послідовності. Так поступово йшли все вище і вище. Тому дана стратегія отримала назву «знизу вгору». З усією очевидністю можна сказати, що вирішувалася грандіозна за масштабами та складністю завдання. І розв'язати цю проблему вчені змогли тільки за допомогою суперкомп'ютерів. В результаті були створені фізичні карти різних областей ДНК і цілих хромосом, що складаються з послідовно перекриваються один з одним фрагментів. Набір таких «родинних» фрагментів отримав назву контіг (рис. 16).
Після появи ефективних методів секвенування ДНК і декількох стратегій використання цього методу став стрімко наростати вал розшифрованих нуклеотиднихпослідовностей, в першу чергу таких простих організмів, як віруси, а також окремих клонованих фрагментів ДНК різних видів вищих організмів. Так, ще в кінці 1970-х років була розшифрована структура першого живого об'єкта - вірусу бактерій - бактеріофага, що позначається як. 174, має довжину 5386 п. Н. Потім послідувала черга інших.
Перші об'єкти для секвенування були обрані невипадково. Більшість з цих мікроорганізмів (архебактерии, спірохети, хламідобактеріі, кишкова паличка, збудники пневмоній, сифілісу, гемофілії, метанобразующие бактерії, мікоплазми, рикетсії, ціанобактерії) здатні викликати різні патології у людини. В даний час багато хто з цих проектів уже завершені; досліджено понад 800 повних клітинних геномів мікоплазм, архей, кишкової палички, збудників ряду хвороб людини, а також пекарських дріжджів, маленького черв'яка-нематоди, дрозофіли та вельми цікавого в практичному плані рослини арабидопсиса. Досить імовірно, що справжнє число секвенувати до теперішнього часу геномів набагато більше, тому що багато фармацевтичні фірми засекречують свої результати, які не публікуючи їх у відкритій пресі.
Таблиця 2. Деякі мікроорганізми, геноми яких повністю секвенувати до теперішнього часу
Поділіться на сторінці