пояснення викладача
Методика проведення заняття та методичні вказівки по темі.
Тема 16. Титрування вірусів
Завдання на наступне заняття.
Підведення підсумків заняття.
Визначити наявність в сироватці крові кролика антитіл до вірусу ньюкаслської хвороби.
Самостійна робота: а) затоку агару на предметні скельця; б) виготовлення лунок в шарі агару; в) розлив компонентів РДП; г) спорядження вологої камери; д) замальовка схеми РДП в зошитах; е) облік результатів РДП і їх внесення в схему РДП виробляються на наступний день або на наступному занятті.
1. У чому принцип РДП?
2. Які завдання дозволяє вирішувати РДП?
3. У чому переваги і недоліки РДП?
Мета заняття: ознайомлення з методикою титрування вірусів
Устаткування і матеріали: завдання на визначення титру вірусу в ЕД50 за фактичними даними, виписані на картки (на кожного студента по одній картці, всього не менше 10 варіантів завдань); аллантоісная рідина курячих зародків, заражених вірусом ньюкаслської хвороби; 1% -ва суспензія відмитих еритроцитів курей; фізіологічний розчин (ізотонічний розчин NaCl); плексигласові панелі з лунками; градуйовані піпетки на 1 мл; гумові груші; судини з дезрозчином; олівці для запису по склу, калькулятори, логарифмічні таблиці, мультимедійне обладнання, презентації MS Office Power Point по темі заняття.
У лабораторних роботах з вірусами, біофабричного виробництві і у ветеринарній практиці постійно виникає необхідність визначення кількості вірусів в тому чи іншому матеріалі. Без такого визначення неможливі експериментальне зараження вірусами живих лабораторних систем, виробництво живих та інактивованих противірусних вакцин і діагностичних препаратів, оцінка активності живих противірусних вакцин, отримання імунних сироваток та багато інших робіт.
Кількість вірусу в будь-якому матеріалі визначають за титром вірусу в цьому матеріалі. Під титром вірусу розуміють вираз його концентрації в матеріалі.
Титр вірусу - це кількість вірусу, що міститься в одиниці об'єму матеріалу. Оскільки кількість вірусу неможливо виразити в які звичайно застосовуються (обсяг, маса і т. П.) Одиницях, вдаються до вимірювання в одиницях дії або одиницях активності. Віруси мають інфекційних та гемагглютинирующих дією. Звідси і одиниці кількості вірусів інфекційні та гемагглютинирующие.
Розмірність цих одиниць зівісіт від співвідношення повноцінних і неповноцінних віріонів в використовуваної суспензії, об'єкта, способу титрування та інших факторів. У практиці знайшли застосування три типи одиниць кількості вірусу: 1-й - інфекційні одиниці локальних пошкоджень, що викликаються вірусами і оцінюються за одиничного ефекту; 2-й - інфекційні одиниці 50% -ного дії вірусів на чутливі живі об'єкти, які оцінюються статистично; 3-й - гемагглютинирующие одиниці.
З локальних пошкоджень, що викликаються вірусами, найбільш відомі бляшки в заражених культурах клітин (острівці мертвих клітин в шарі живих) і оспини (некротичні вузлики) на ХАО курячих ембріонів, заражених оспеннимі і деякими іншими вірусами. У випадках такої прояви інфекційної активності вірусів кількість вірусу може бути виміряна в бляшкообразующіх одиницях (БОЮ) або оспообразующіх одиницях (оое). Одна БОЮ дорівнює дозі вірусу, здатної викликати утворення однієї бляшки, а одна оое - однієї оспини.
Найбільш універсальний метод визначення титру вірусу в одиницях 50% -ного інфекційного дії. За цим методом за одиницю кількості вірусу приймається така його доза, яка здатна викликати інфекційний ефект у 50% заражених тест-об'єктів. Вона позначається як ЕД50 - ефективна 50% -ва доза. Число таких доз вірусу в одиниці об'єму матеріалу і буде висловлювати титр вірусу в цьому матеріалі.
Види одиниць кількості вірусів при визначенні по 50% -ному інфекційного дії
Види інфекційного дії вірусів
Як тест-об'єктів в лабораторіях зазвичай використовують білих мишей, курячі ембріони і культури клітин, у яких інфекційне дію вірусу може проявлятися загибеллю, клінічними симптомами, патолого змінами і цитопатическим ефектом. Для кожного вірусу підбирають чутливий до нього тест-об'єкт і форму обліку його інфекційного дії, по якій оцінюють ефект зараження. Залежно від виду тест-об'єкта і форми прояву інфекційного дії ЕД50 приймає один з наступних видів, наведених у таблиці 6.
1 ЛД50 це доза вірусу, що вбиває 50% лабораторних тварин (зазвичай білих мишей);
1 ІД50 -доза вірусу, що викликає клінічні симптоми або патологоанатомічні зміни у 50% заражених лабораторних тварин;
1 ЕЛД - доза вірусу, що вбиває 50% курячих ембріонів;
1 ЕІД50 -доза вірусу, що викликає патологоанатомічні зміни у 50% заражених курячих ембріонів;
1 ЦПД50 - доза вірусу, що викликає цитопатичної ефект у 50% заражених культур клітин (зазвичай пробірок з культурами клітин).
Кількість ЕД50 (ЛД50. ІД ЕЛД50. ЕІД50 або ЦПД50) вірусу, що міститься в одиниці об'єму віруссодержащего матеріалу, і буде вираженням титру (Т) вірусу в цьому матеріалі. Наприклад, Т = 10 3,48 ЦПД50 / 0,1 мл означає, що в кожній 0,1 мл віруссодержащего матеріалу міститься 10 3 '48 доз вірусу (т. Е. Понад 1000, але менш 10 000, а саме 10 3, 48 = 3020), кожна з яких здатна викликати цитопатичної ефект в 50% пробірок з культурою клітин.
Названі одиниці 50% -ного інфекційного дії вірусу (ЛД50. ІД50. ЕЛД50. ЕІД50. ЦПД50) використовуються у випадках оцінки інфекційного дії вірусу зі статистично оцінюваним ефектом, мають місце, коли облік інфекційного дії вірусу ведеться по летального дії, клінічних симптомів, патологоанатомічним змінам або цитопатичної дії.
Титрування вірусів по 50% -ному інфекційного дії - найбільш універсальний прийом, придатний для титрування практично будь-якого вірусу, якщо підібрати чутливу до нього живу систему (текст-об'єкт). Однак цей метод титрування вірусів досить трудомісткий, тривалий і вимагає статистичних розрахунків.
Завдання визначення титру вірусу в одиницях 50% -ного інфекційного дії (ЛД50. ІД50. ЕЛД50. ЕІД50. ЦПД50) зводиться до того, щоб знайти таке розведення випробуваного віруссодержащего матеріалу, в обсязі, що заражає дози якого містилася б одна ЕД50. а потім розрахувати, скільки таких одиниць вірусу міститься в такому ж обсязі віруссодержащего матеріалу, що і буде показником титру вірусу в цьому матеріалі.
Щоб вирішити це завдання, спочатку з досліджуваного віруссодержащего матеріалу готують ряд послідовних 10-кратних розведень. 10-кратні розведення беруть з двох причин:
по-перше, як видно з графіка залежності інфекційного ефекту від дози вірусу (рис. 35), крива цієї залежності поблизу точки, відповідної ЕД50. на значному відрізку наближається до прямої.
Малюнок 35. Графік залежності інфекційного ефекту від дози вірусу
Це означає, що в певних межах, центр яких в точці ЕД50. між логарифмом дози (розведення) вірусу і інфекційним ефектом існує прямолінійна залежність, т. е. величина інфекційного ефекту пропорційна логарифму дози вірусу (або його розведення), в області малих і особливо великих доз ця залежність порушується;
по-друге, при 10-кратному розведенні полегшуються подальші розрахунки.
Однаковими обсягами кожного з 10-кратних розведень досліджуваного віруссодержащего матеріалу заражають рівні групи чутливих до даного вірусу живих тест-об'єктів (мишей, курячих ембріонів або культур клітин). При цьому в кожній групі повинно бути не менше 4-6 тест-об'єктів, так як при меншій кількості статистично розраховується величина титру вірусу матиме дуже велику похибку (статистична величина тим точніше, ніж на більшій кількості вихідних даних вона заснована).
Після зараження враховують результат дії вірусу (загибель, клінічні симптоми, патологоанатомічні зміни або ЦПЕ) на заражені об'єкти і визначають, в якому розведенні вірус проявив свою дію на 50% чутливих об'єктів. Розведення, що дає 50% -ний ефект, розраховують методом прямолінійної інтерполяції. Коли таке розведення знайшли, то вважають, що в заражає обсязі вірусу, розведеного в знайдене (відповідне 50% -ному ефекту) число раз, міститься 1 ЕД50. В такому ж обсязі вихідного (нерозведеного) віруссодержащего матеріалу таких доз (ЕД50) міститься більше у стільки разів, у скільки був розлучений матеріал, що дав 1 ЕД50. Потім перераховують, скільки таких одиниць 50% -ного інфекційного дії вірусу міститься в одиниці об'єму (мл) віруссодержащего матеріалу, що і буде вираженням титру вірусу в даному матеріалі.