Лабораторна діагностика дифтерії
Дифтерія - гостре інфекційне захворювання, що викликається дифтерійної паличкою (Corynebacterium diphtheriae), характерізующеесяместним фібринозним ураженням слизових оболонок рото-і носоглотки (diphthera - плівка), а також важкою інтоксикацією з ураженням серцево-судинної, нервової системи і наднирників. Лабораторна діагностика дифтерії здійснюється відповідно до схеми 14.
Схема 14.Мікробіологіческая діагностика дифтерії
Мікроскопічний метод в даний час практично не застосовується через його низьку інформативності в зв'язку з суб'єктивізмом обліку і виконується тільки на вимогу лікаря. Мікроскопії піддають мазки, пофарбовані по Граму, метиленовим синім, по Нейссеру (для виявлення включень волютина). Дифтерійні палички (Corynebacteriumdiphtheriae) при забарвленні за Нейссеру містять полярно розташовані темно-сині, майже чорні, включення волютина і розташовуються у вигляді римських цифр V або Х, тоді як подібні з ними діфтероіди і ложнодіфтерійной бактерії (Corynebacteriumpseudodiphtheriae) зерен волютина не мають і розташовуються в вигляді частоколу. Розроблено також метод прямого флюорохромірованія дифтерійних паличок коріфосфіном, забарвлює включення волютина в червоно-коричневий колір, а цитоплазму в зелений або жовтий колір, що дозволяє підвищити ефективність бактериоскопического методу.
Бактеріологічний метод основний метод діагностики дифтерії. Досліджуваний матеріал засівають на одну зі спеціальних поживних середовищ для культивування дифтерійних паличок, найбільш часто на середу Клауберга (МПА з гли-стирол, дефібринованої кров'ю і телуриту натрію, що затримує ріст супутньої непатогенної мікрофлори). На середовищі Клауберга Corynebacterium diphtheriae утворює 2 типу колоній:
а) сірувато-чорного кольору з радіальної смугастість поверхні, що нагадують коль-ток маргаритки або розетку (біовар gravis);
б) чорні, круглі, опуклі колонії колонії за рахунок відновлення теллурита (біовар mitis).
В мазку з типовою для дифтерійної палички колонії виявляють грампозитивні палички булавовидний форми, розташовані у вигляді римських цифр V або Х, що містять зерна волютина (рис. 16). Частину колонії пересівають на кров'яний МПА для виділення чистої культури.
Мал. 16. Збудник дифтерії - Corynebacteriumdiphtheriae. Забарвлення по Нейссеру. Розташування у вигляді римських цифр V або Х, включення волютина по полюсах. х900
Ідентифікацію виділеної культури проводять з урахуванням, перш за все, ключових властивостей (токсигенность, наявність цистиназу). Токсигенність зазвичай визначають за допомогою реакції преципітації в гелі ( «чашковий» метод). Для цього в чашку Петрі з живильним середовищем (МПА, 15-20% кінської сироватки, 0,3% мальтози, 0,03% цистину) накладають смужку фільтрувального паперу, просочену анти-токсичної протидифтерійної сироваткою (5000 АЕ / мл), чашку підсушують 30 хвилин в термостаті, після чого засівають штрихами досліджувані культури перпендикулярно смужці паперу. В якості контролю використовують Токсигенні куль-туру. Посіви інкубують в термостаті при 37 0 С протягом 18-20 годин. При наявності токсигенности в місцях з'єднання ток-сина з антитоксическими антитілами в живильному середовищі утворюються білі лінії преципитата, що нагадують вусики. Для визначення токсигенності дифтерійних бактерій також розроблені ІФА і ПЛР.
Цистиназу у виділених культур (проба Пізу) визначають шляхом посіву методом уколу петлі досліджуваної культури на цистиновий МПА з азотнокислим свинцем. Посіви поміщають на добу в термостат при 37 0 С. При наявності цистиназу в середовищі утворюється почорніння (освіта сульфіду свинцю) по ходу уколу, навколо якого з'являється коричневе хмарка.
Виділену культуру ідентифікують і диференціюють від подібних з нею непатогенних коринебактерій за біологічними властивостями (табл. 16). Для визначення уреази петлю досліджуваної культури вносять в пробірку, що містить спиртовий розчин сечовини та індикатор феноловий червоний. Пробірку витримують 30 хвилин в термостаті при 37 0 С, при наявності уреази вміст пробірки забарвлюється в червоний колір.
При виділенні нетоксігенним культури ставлять реакцію аглютинації з протидифтерійної сироваткою для виявлення видового антигену Corynebacterium diphtheriae.
Серологічний метод - РА, РНГА з метою визначення антитіл в парних сироватках крові хворих на дифтерію.
Таблиця 16.Біологіческіе властивості коринебактерій