Як відбувається синтез білка
У кожній області науки є своя «синій птах»; кібернетики мріють про «думаючих» машинах, фізики - про керовані термоядерні реакції, хіміки - про синтез «живої речовини» - білка. Синтез білка довгі роки був темою фантастичних романів, символом майбутнього могутності хімії. Це пояснюється і тією величезною роллю, яка належить білку в світі живого, і тими труднощами, які неминуче поставали перед кожним сміливцем, який відважився «скласти» з окремих амінокислот хитромудру мозаїку білка. І навіть ще не самого білка, а тільки пептидів.
Різниця між білками і пептидами не тільки термінологічна, хоча молекулярні ланцюги і тих і інших складаються з амінокислотних залишків. На якомусь етапі кількість переходить в якість: пептидная ланцюг - первинна структура - отримує можливість згортатися в спіралі і клубки, утворюючи вторинну і третинну структури, характерні вже для живої матерії. І тоді пептид стає білком. Чіткої межі тут не існує - на полімерного ланцюга не можна поставити демаркаційний знак: досель - пептид, звідси - білок. Але відомо, наприклад, що адранокортікотропний гормон, що складається з 39 залишків амінокислот, - це поліпептид, а гормон інсулін, що складається з 51 залишку у вигляді двох ланцюгів, - це вже білок. Найпростіший, але все ж білок.
Спосіб з'єднання амінокислот в пептиди був відкритий на початку минулого століття німецьким хіміком Емілем Фішером. Але ще довго після цього хіміки не могли всерйоз думати не тільки про синтез білка або 39-членних пептидів, але навіть значно більш коротких ланцюгів.
Процес синтезу білка
Для того, щоб з'єднати між собою дві амінокислоти, треба подолати чимало труднощів. Кожна амінокислота, подібно дволикого Януса, має два хімічних особи: карбоксильну кислотну групу на одному кінці і амінну основну групу - на іншому. Якщо від карбоксилу однієї амінокислоти відняти групу ОН, а від аминной групи інший - атом водню, то утворилися при цьому два амінокислотних залишку можуть з'єднатися один з одним пептидним зв'язком, і в результаті виникне найпростіший з пептидів - дипептид. І отщепа молекула води. Повторюючи цю операцію, можна нарощувати довжину пептиду.
Однак ця, здавалося б, на перший погляд нескладна операція практично трудноосуществима: амінокислоти дуже неохоче з'єднуються один з одним. Доводиться їх активувати, хімічно, і «підігрівати» один з кінців ланцюга (найчастіше карбоксильний), і вести реакцію, строго дотримуючись необхідні умови. Але це ще не все: друга складність полягає в тому, що з'єднуватися один з одним можуть не тільки залишки різних амінокислот, але і дві молекули однієї кислоти. При цьому будова синтезованого пептиду буде вже відрізнятися від бажаного. Більше того, кожна амінокислота може мати не дві, а кілька «ахіллесових п'ят» - бічних хімічно активних груп, здатних приєднувати амінокислотні залишки.
Щоб не дати реакції згорнути з заданого шляху, необхідно закамуфлювати ці помилкові мішені - «запечатати» на час здійснюваної реакції все реакційно здатні групи амінокислоти, крім однієї, приєднавши до них так звані захисні угруповання. Якщо цього не зробити, то мета буде рости не тільки з обох кінців, але і вбік, і амінокислоти вже не вдасться з'єднати в заданій послідовності. А адже саме в цьому і полягає сенс будь-якого спрямованого синтезу.
Але, позбавляючись таким чином від однієї неприємності, хіміки зіткнулися з іншою: захисні угруповання після закінчення синтезу потрібно видалити. За часів Фішера як «захисту» застосовувалися угруповання, які відщеплюються гідролізом. Однак реакція гідролізу зазвичай виявлялася занадто сильним «потрясінням» для отриманого пептиду: насилу побудована його «конструкція» розвалювалася як тільки з неї знімали «будівельні ліси» - захисні угруповання. Лише в 1932 році учень Фішера М. Бергманн знайшов вихід з цього становища: він запропонував захищати аминогруппу амінокислоти карбобензоксігруппой, яку можна було видалити без пошкодження пептидного ланцюга.
Синтез білка з амінокислот
Протягом наступних років був запропонований ряд так званих м'яких методів «зшивання» амінокислот один з одним. Однак всі вони фактично були лише варіаціями на тему методу Фішера. Варіаціями, в яких іноді навіть важко було вловити вихідну мелодію. Але сам принцип залишався все тим же. І все тими ж залишалися труднощі, пов'язані із захистом вразливих груп. За подолання цих труднощів доводилося розплачуватися збільшенням числа стадій реакції: один елементарний акт - з'єднання двох амінокислот - розпадався на чотири етапи. А кожна зайва стадія - це неминучі втрати.
Якщо навіть припустити, що кожна стадія йде з корисним виходом в 80% (а це хороший вихід), то через чотири етапи ці 80% «розтануть» до 40%. І це при синтезі тільки дипептида! А якщо амінокислот буде 8? А якщо 51, як в інсуліні? Додайте до цього складності, пов'язані з існуванням двох оптичних «дзеркальних» форм молекул амінокислот, з яких в реакції потрібна тільки одна, приплюсуйте проблеми відділення утворюються пептидів від побічних продуктів, особливо в тих випадках, коли вони однаково розчинні. Що ж вийде в сумі: Дорога в нікуди?
І все ж ці труднощі не зупиняли хіміків. Погоня за «синім птахом» тривала. У 1954 році були синтезовані перші біологічно активні гормони-поліпептиди - вазопресин і окситоцин. У них було по вісім амінокислот. У 1963 році був синтезований 39-членний поліпептид АКТГ - адренокортикотропний гормон. Нарешті, хіміки США, Німеччини та Китаю синтезували перший білок - гормон інсулін.
Як же так, скаже Новомосковсктель, важка дорога, виявляється, привела не в нікуди і не куди-небудь, а до здійснення мрії багатьох поколінь хіміків! Це ж епохальна подія! Вірно, це - епохальна подія. Але давайте оцінимо його тверезо, відмовившись від сенсаційності, знаків оклику і надмірних емоцій.
Ніхто не сперечається: синтез інсуліну - величезна перемога хіміків. Це колосальний, титанічна праця, гідний будь-якого захоплення. Але разом з тим его, по суті, і стелю старої хімії поліпептидів. Це перемога на межі поразки.
Синтез білків і інсулін
В інсуліні 51 амінокислота. Щоб з'єднати їх в потрібній послідовності, хімікам потрібно було провести 223 реакції. Коли через три роки після початку першої з них була закінчена остання, вихід продукту становив менше однієї сотої відсотка. Три роки, 223 стадії, сота частка відсотка - погодьтеся, перемога носить чисто символічний характер. Говорити про практичне застосування цього методу дуже важко: надто великі пов'язані з його реалізацією витрати. А адже в кінцевому рахунку мова йде про синтез не дорогоцінний реліквій слави органічної хімії, а про випуск життєво важливого лікарського препарату, який необхідний тисячам людей у всьому світі. Так класичний метод синтезу поліпептидів вичерпав себе на першому ж, найпростішому білку. Значить, «синій птах» знову вислизнула з рук хіміків?
Новий метод синтезу білка
Основна ідея нового методу полягає в тому, що зростаючі ланцюжка пептидів, які раніше були кинуті хаотичного руху в розчині, тепер прив'язувалися одним кінцем до твердого носія - їх як би змушували стати на якір в розчині. Меріфілд брав тверду смолу і до її активним групам «прив'язував» за карбонільний кінець першу з зібраних в пептид амінокислоту. Реакції йшли всередині окремих частинок смоли. У «лабіринтах» її молекул спочатку з'являлися перші короткі паростки майбутнього пептиду. Потім в посудину вводили другу амінокислоту, її молекули зшивалися своїми карбонільних кінцями з вільними амінними кінцями «прив'язаною» амінокислоти, і в частинках виростав ще один «поверх» майбутнього «будівлі» пептиду. Так, етап за етапом, поступово нарощувався весь пептидний полімер.
Новий метод мав безсумнівні переваги: перш за все в ньому була вирішена проблема відділення непотрібних продуктів після приєднання кожної чергової амінокислоти - ці продукти легко змивалися, а пептид залишався пришитим до гранул смоли. Одночасно виключалася проблема розчинності зростаючих пептидів - один з головних бичів старого методу; раніше вони нерідко випадали в осад, практично перестаючи брати участь в процесі росту. Пептиди, «знімаються» після закінчення синтезу з твердої підкладки, виходили майже всі однакового розміру і будови, у всякому разі, розкид в структурі був менше, ніж при класичному методі. І відповідно більше корисний вихід. Завдяки цьому методу синтез пептидів - кропітка, трудомісткий синтез - легко піддається автоматизації.
Меріфілд спорудив нескладний автомат, який сам за заданою програмою проробляв всі належні операції - подачу реагентів, змішування, слив, промивку, відмер дози, додавання нової порції і так далі. Якщо за старим методом на приєднання однієї амінокислоти доводилося труїти 2-3 дня, то Меріфілд на своєму автоматі з'єднував за день 5 амінокислот. Різниця - в 15 разів.
У чому полягають труднощі синтезу білків
Метод Меріфілда, названий твердофазним, або гетерогенним, відразу ж був прийнятий на озброєння хіміками усього світу. Однак вже через короткий час стало ясно: новий метод разом з великими перевагами має і ряд серйозних недоліків.