Антитіла до натрійуретічеським пептидів probnp
історичний аспект
У 1988 році з мозку свині був виділений пептид, який отримав назву мозковий натрійуретичний пептид (Brain Natriuretic Peptide, BNP). Пізніше було показано, що BNP експресується переважно в кардіоміоцитах, тому останнім часом частіше використовується назва «натрійуретичний пептид B-типу» (B-type Natriuretic Peptide).
Будова натрійуретичний пептид
Амінокислотна послідовність натрійуретичний пептид високогомологічна. Натрийуретические пептиди містять центральне кільце, що складається з 17 амінокислотних залишків (а.к.о.), замкнутий дисульфідній зв'язком між двома залишками цистеїну, і бічні ланцюги різної довжини. BNP людини складається з 32 а.к.о. ANP - з 28 а.к.о. Для CNP відомі дві форми, що складаються з 22 і 53 а.к.о. що відрізняються довжиною N-кінцевої ділянки. Амінокислотні послідовності всередині кільця високогомологічни - 11 з 17 А.К. ідентичні для всіх трьох пептидів (Рис. 1).
Мал. 1. Амінокислотна послідовність натрійуретичний пептид ANP, BNP і CNP людини. Темним кольором виділені амінокислотні залишки, загальні для всіх трьох пептидів.
Синтез і секреція BNP
Основним місцем синтезу BNP є кардіоміоцити. Експресія мРНК BNP була виявлена як в передсердях, так і в шлуночках серця. Однак вважається, що лівий шлуночок є основним джерелом BNP в організмі. Секреція BNP в кровотік відбувається в міру синтезу, лише невелика кількість синтезованого BNP запасається в передсердних секреторних гранулах. Це принципово відрізняє BNP від ANP, для якого показано, що основна частина синтезованого пептиду запасається у вигляді молекул-попередників в секреторних гранулах.
Рівень експресії гена BNP і секреція BNP в кровотік значно збільшуються у відповідь на підвищення тиску на стінки камер серця. Збільшення рівня експресії гена BNP спостерігається при різних серцевих захворюваннях, а також при захворюваннях легенів і порушення функції нирок. Однак найбільш високі концентрації BNP в крові виявляються у хворих з серцевою недостатністю.
BNP синтезується кардиомиоцитами у вигляді прогормона proBNP, що складається з 108 а.к.о. (11905 Да). Освіта активного гормону відбувається в результаті розщеплення proBNP специфічною конвертазой між 76 і 77 А.К. (Рис. 2). Розщеплення proBNP призводить до утворення С-кінцевого фрагмента BNP (32 а.к.о. 3466 Да), і N-кінцевого фрагмента (N-terminal proBNP, NT-proBNP), що складається з 76 а.к.о. (8457 Да). Вважається, що розщеплення proBNP відбувається або внутрішньоклітинно, або на поверхні кардіоміоцитів при секреції в кровотік. Фермент, який відповідає за розщеплення proBNP, достовірно не встановлено. Передбачається, що одна з двох конвертаз (фурин або Корін) бере участь в процессинге proBNP. Обидва фрагмента BNP і NT-proBNP виділяються в кров в еквімолярних співвідношенні (тому концентрація NT-proBNP в крові також збільшується при підвищенні рівня експресії гена BNP). Вважається, що NT-proBNP не активний і не володіє біологічною функцією.
Мал. 2. Схема освіти BNP людини.
Достовірно показано, що частина молекул proBNP не розщеплюються в кардіоміоцитах і секретуються в кров разом з BNP і proBNP. Причому, концентрація proBNP в крові в кілька разів перевищує концентрацію активного гормону BNP. Механізми, які можуть призводити до появи нерасщепленного proBNP в крові, причини високого співвідношення концентрацій proBNP / BNP в крові, а також значення неповного процесингу proBNP для організму активно вивчаються.
Фізіологічна дія BNP
BNP є антагоністом симпатичної нервової системи і ренін-ангіотензин-альдостеронової системи, активність яких підвищується при серцевій недостатності. Нижче представлені основні фізіологічні ефекти натрійуретичний пептид:
інгібування реабсорбції натрію в проксимальному і дистальному канальцях
збільшення проникності ендотелію
підвищення натрийуреза і діурезу
розслаблення стінок і розширення кровоносних судин, зниження артеріального тиску
підвищення швидкості клубочкової фільтрації в нирках
інгібування гіпертрофії кардіоміоцитів і фіброзу серця
Фактори, що впливають на рівень BNP і NT-proBNP в крові
В даний час BNP і NT-proBNP широко використовуються в клінічній практиці в якості біохімічних маркерів серцевої недостатності.
У здорових людей концентрація BNP в крові становить 10-70 пг / мл, NT-proBNP- 20-300 пг / мл. При серцевої недостатності концентрація BNP може збільшуватися до 5 нг / мл, NT-proBNP - до 100 нг / мл. Більш високі концентрації NT-proBNP в крові в порівнянні з BNP пов'язані з великим часом життя NT-proBNP в кровотоці.
Однак рівень BNP і NT-proBNP в крові підвищується не тільки при серцевій недостатності, а й при інших патологіях, що необхідно враховувати при постановці діагнозу (Таблиця 1).
Рівень BNP і NT-proBNP в крові залежить від статі (вище у жінок, ніж у чоловіків) і віку. Рівень обох маркерів в крові підвищується зі збільшенням віку пацієнта. У зв'язку з цим було запропоновано використовувати різні порогові значення в залежності від статі і (або) віку хворого. Так, компанія Roche рекомендує використовувати різні порогові значення концентрації NT-proBNP для пацієнтів у віці до 75 років (125 пг / мл) і старше 75 років (450 пг / мл). У той же час в методах для визначення BNP рекомендується використовувати єдиний пороговий рівень 100 пг / мл для всіх пацієнтів.
Також на концентрацію BNP і NT-proBNP в крові впливають рівень гемоглобіну і маса тіла. Концентрація обох пептидів в крові підвищується при анемії. У пацієнтів з високим індексом маси тіла (більше 25 кг / м 2) концентрація BNP і NT-proBNP значно нижче, ніж у пацієнтів з нормальною масою тіла.
Методи для визначення BNP і NT-proBNP в крові
Сучасні методи кількісного визначення BNP і NT-proBNP в крові розроблені на основі методу сендвіч-імуноаналізу. Метод дозволяє домогтися високої чутливості, що вкрай важливо, враховуючи низький рівень BNP і NT-proBNP в крові здорових людей. Чутливість існуючих методів для визначення BNP становить 1-10 пг / мл, NT-proBNP - 5-15 пг / мл.
У методах для визначення BNP використовується пара моноклональних антитіл, або комбінація моно- і поліклональних антитіл (Таблиця 2). Наприклад, одне з використовуваних антитіл специфічно до кільцевої структурі, а інше до C-кінцевого або N-кінцевому ділянці пептиду. Оскільки для натрійуретичний пептид характерна висока ступінь гомології, для створення діагностичних систем відбираються антитіла, що не володіють перехресним взаємодією з ANP і CNP. Використання антитіл різної епітопной специфічності, а також відмінності в калібратори призводять до того, що результати вимірювання BNP в одному і тому ж зразку, отримані з використанням різних методів, можуть відрізнятися.
* Обидві системи Triage і Beckman використовують ті ж самі антитіла, але не є однаковими, тому що мають відмінності в підходах використання моноклональних і поліклональних антитіл в якості антитіл підкладки та детекторних антитіл.
Фактори, що впливають на визначення концентрації BNP і NT-proBNP
Глікозилювання молекулNT-proBNP. Центральна частина молекули NT-proBNP глікозильованого. Глікозилювання негативно впливає на вимірювання концентрації NT-proBNP в крові, оскільки вуглеводні залишки перешкоджають взаємодії антитіл з NT-proBNP. Епітопи використовуваних в діагностичних системах антитіл розташовані поблизу сайтів глікозилювання молекули NT-proBNP (ділянки 39-50 і 42-46). Це призводить до того, що концентрація NT-proBNP в зразках серйозно (іноді в кілька разів) недооцінюється. Рівень гликозилирования NT-proBNP відрізняється у пацієнтів, тому похибка методу не постійна. Клінічне значення цього не встановлено, ведуться дослідження.
Стабільність BNP і NT-proBNP в зразках
Для визначення рівня BNP використовується тільки EDTA-плазма, або цільна кров, зібрана в пробірки, що містять EDTA (TriageBNP). Концентрація BNP, певна в зразках сироватки, гепариновой і цитратной плазми виявляється значно нижче концентрації, визначеної в EDTA-плазмі.
Invitro стабільність BNP відрізняється для різних методів (залежить від епітопів антитіл). Плазму, призначену для вимірювання концентрації BNP, рекомендується зберігати при 0-4 ° С і проводити вимірювання концентрації якомога швидше. В цілому, BNP стабільний протягом 4 годин зберігання при кімнатній температурі і 8 годин при температурі 4 ° C в пробах цільної крові, що містить EDTA.
Для вимірювання концентрації NT-proBNP можуть бути використані сироватка, гепариновая і EDTA-плазма. NT-proBNP стабільний в сироватці протягом 72 годин інкубації при кімнатній температурі.
BNP і NT-proBNP як біохімічні маркери серцевої недостатності
Складність діагностики серцевої недостатності полягає в відсутності адресності симптомів (задишка, швидка стомлюваність, набряки), які можуть бути викликані іншими захворюваннями, або виникати через ожиріння або погану фізичну форму пацієнтів. Численні дослідження підтвердили ефективність використання BNP і NT-proBNP при обстеженні пацієнтів з гострою та хронічною серцевою недостатністю. Однак необхідно мати на увазі, що для обох маркерів характерна висока чутливість, але відносно низька специфічність при визначенні серцевої недостатності. Низька специфічність пов'язана з тим, що рівень обох маркерів може підвищуватися при інших захворюваннях. Тому вимірювання концентрації BNP (NT-proBNP) доцільно використовувати в якості первинного діагностичного тесту. Якщо концентрація BNP (NT-proBNP) в крові нижче порогового рівня, то серцева недостатність може бути виключена з високою ймовірністю
98%. У тому випадку, якщо концентрація BNP (NT-proBNP) підвищена, то потрібне проведення ехокардіографії для того щоб підтвердити наявність дисфункції лівого шлуночка. Таким чином, вимірювання концентрації BNP (NT-proBNP) дозволяє зменшити групу пацієнтів, яким потрібне проведення ехокардіографії. У разі гострої серцевої недостатності, вимірювання концентрації BNP (NT-proBNP) дозволяє швидше встановити правильний діагноз і почати терапію. Таким чином, BNP (NT-proBNP) використовуються не для встановлення діагнозу серцевої недостатності, а для її виключення у пацієнтів з вираженими симптомами. В даний час вимірювання концентрації BNP (NT-proBNP) поряд з клінічним обстеженням, ехокардіографії, електрокардіографією і рентгенографією грудної клітини рекомендовано Європейським товариством кардіологів для використання при діагностиці серцевої недостатності і дисфункції лівого шлуночка серця.