альтернативний сплайсинг
Альтернативний сплайсинг мРНК
Альтернативний сплайсинг - процес, що дозволяє одному гену виробляти кілька мРНК і, відповідно, білків. Більшість генів в еукаріотичних геномах містять Екзони і інтрони. Після транскрипції в процесі сплайсингу інтрони видаляються з пре-мРНК. А ось екзон може включатися (чи ні) до складу кінцевого транскрипта. Таким чином, за допомогою альтернативного сплайсингу можна отримати безліч транскриптов, а, отже, і білків. Об'єднання різних сайтів сплайсингу дозволяє індивідуальним генам експресувати безліч мРНК. які кодують білки, часом, з антагоністичними функціями. Екзон одного варіанта сплайсингу може виявитися Інтроном в альтернативному шляху. Різні варіанти сплайсингу можуть призводити до утворення різних ізоформ одного і того ж білка. Наприклад, ген тропонина складається з 18 екзонів і кодує численні ізоформи цього м'язового білка. Різні ізоформи тропоніну утворюються в різних тканинах і на певних стадіях їх розвитку.
Припущено, що у еукаріот альтернативний сплайсинг може бути важливим еволюційним досягненням: підвищилася ефективність зберігання інформації. [1] Нещодавно було показано, що у приблизно 95% мультіекзонних генів людини спостерігається альтернативний сплайсинг. [2] Геном круглого хробака Caenorhabditis elegans за кількістю генів практично не відрізняється від генома людини, проте альтернативного сплайсингу піддаються пре-мРНК тільки 15% генів. Таким чином, альтернативний сплайсинг дозволяє збільшити різноманітність білкових продуктів генів. зберігаючи при цьому відносно невелика кількість різних генів в геномі і не створюючи надлишкових копій генів.
Різні варіанти альтернативного сплайсингу однієї пре-мРНК можуть здійснюватися в різні періоди розвитку організму і / або в різних тканинах, а також у різних особин одного виду. [3]
Один з найбільш вражаючих прикладів альтернативного сплайсингу - ген dscam в Drosophila melanogaster. що містить 116 екзонів, з яких 17 завжди потрапляють в кінцеву мРНК. Теоретично, дана система може продукувати 38016 різних білків. Насправді, виявлено понад 18000 в Drosophila melanogaster. Білки Dscam відповідають за правильне місцезнаходження нейронів і також, ймовірно, беруть участь в розпізнаванні і фагоцитозі чужорідних бактерій. [4]
Класифікація
Alt splicing bestiary
Існує кілька механізмів альтернативного сплайсингу:
- Пропуск екзона або екзонних касети. в цьому випадку екзон може вирізатися з первинного транскрипту або зберігатися в ньому. Це найбільш часто використовуваний механізм у ссавців.
- Взаємовиключні Екзони. з двох екзонів в кінцевому транскрипт зберігається тільки один.
- Використання альтернативного донорного сайту. є кілька альтернативних 5'-ділянок сплайсингу (донорних сайтів), що змінює 3'-кордон вишележащего (upstream) екзона.
- Використання альтернативного акцепторного сайту. використовуються різні 3'-ділянки сплайсингу (акцепторні сайти), що змінює 5'-кордону нижчого (downstream) екзона.
- Утримання інтрона. Інтрон зберігається в послідовності транскрипта. Якщо інтрон знаходиться в кодує послідовності, то він може кодувати стоп-кодон або ж зрушувати рамку зчитування. А це може призвести до втрати функціональності білка, тому даний механізм альтернативного сплайсингу використовується вкрай рідко у ссавців.
Крім описаних основних механізмів альтернативного сплайсингу існує ще 2 інших механізму, завдяки яким різні мРНК можуть виходити з одного гена: множинні промотори і множинні сайти поліаденілювання. Транскрипція може починатися з різних точок. В результаті виходять транскрипти з різними екзонами на 5'-кінці (множинні промотори). Множинні сайти поліаденілювання забезпечують різні 3'-кінці для транскрипта. Обидва механізми знайдені в комбінації з альтернативним сплайсингом і додають різноманітності в типи мРНК, отриманих від одного гена. [2] [5]
Сплайсинг здійснюється сплайсосома - масивної структурою, до складу якої входить 5 малих ядерних нуклеопротеїдних частинок (snRNP) - U1, U2, U4, U5 і U6 (U3 не бере участі в сплайсинге) - і великої кількості допоміжних білків. Разом вони здатні точно розпізнати сайти сплайсингу і каталізувати 2 кроку реакції сплайсингу.
Збірка сплайсосома починається з розпізнавання U1 5'-сайту сплайсингу. Після цього фактор сплайсингу 1 (SF1) зв'язується в точці розгалуження (branch point, зазвичай це аденозин). Такий комплекс носить назву E '. Потім велика субодиниця (65 kDa) гетеродімерного допоміжного фактора U2 (U2AF) утворює комплекс з поліпірімідіновим ділянкою (polypyrimidine tract), а мала субодиниця (35 kDa) U2AF зв'язується з 3'-термінальним AG на стику інтрона і екзона. Весь цей утворився комплекс є АТФ-незалежним і вже називається комплексом E. Пізніше, після заміни SF1 на U2 в точці розгалуження, комплекс Е стає АТФ-залежним комплексом А.
Подальшу освіту потрійного U4 / U6-U5 комплексу призводить до формування комплексу В, який після екстенсивних конформаційних змін і перебудов перетворюється в каталитически активний комплекс С. [6] U6 займає позицію U1, а U1 і U4 йдуть. Що залишився комплекс зазнає 2 реакції переетерифікації. В ході першої реакції, 5'-кінець інтрона отщепляется від екзона, що перед ним, і приєднується до сайту розгалуження А через 2 ', 5'-фосфодіефірную зв'язок. У другій реакції переетерифікації, 3'-кінець інтрона отщепляется від екзона, що розташований далі по послідовності, і два екзона об'єднуються. Утворився інтрон вивільняється в формі ласо і пізніше деградує. [7]
Існують різні способи регуляції альтернативного сплайсингу: РНК-білкові взаємодії, РНК-РНК взаємодії (при взаємовиключних екзонах), взаємодія пре-мРНК з некодуючими РНК, в тому числі малими ЯДЕРЦЕВОГО РНК та ін. Незважаючи на настільки потенційне розмаїття регуляторних механізмів, РНК-білкові взаємодії вважаються основними способами регуляції сплайсингу. [8]
регуляторні елементи
- енхансери сплайсингу екзонів (exonic splicing enhancers, ESEs)
- сайленсери сплайсингу екзонів (exonic splicing silencers, ESSs)
- енхансери сплайсингу інтронів (intronic splicing enhancers, ISEs)
- сайленсери сплайсингу інтронів (intronic splicing silencers, ISSs)
Регулятори, що допомагають розпізнати сайт сплайсингу
Білки SR (серин (S) / аргінін (R) -Багатий білки) відіграють важливу роль в розпізнаванні сайту сплайсингу. Наприклад, коли вони взаємодіють з енхансером екзонів (ESE), вони допомагають зв'язуватися U1 з 5'-сайтом сплайсингу. а також U2AF і U2 з 3'-сайтом сплайсингу. Ці взаємодії (SR c енхансером) відбуваються завдяки їх RS доменів (містять Arg-Ser повтори). Білки SR можуть працювати разом з іншими позитивними регуляторами. [6]
SR білок SRp38 (також відомий як TASR, NSSR, FUSIP1 і SRrp40) в дефосфорілірованном діє як репрессор сплайсингу. [9] Однак, недавні дослідження показали, що в фосфорильованому стані він також функціонує в якості активатора, що залежить від сплайсіруемой послідовності. [10]
Інгібування розпізнавання сайту сплайсингу
Пригнічувати розпізнавання сайту сплайсингу можна різними способами. Перший, коли сайленсери сплайсингу розташовуються близько до сайту сплайсингу або до енхансером сплайсингу. і, відповідно, може відбуватися стерическое інгібування, при якому блокується доступ до snRNP або позитивним регуляторним факторів. Наприклад, поліпірімідін-зв'язуючий білок (PTB; також відомий як PTB1 і hnRNP I), зв'язується з поліпірімідіновим ділянкою і, тим самим, блокує зв'язування U2AF з екзонами. Тканеспеціфічние фактори сплайсингу FOX1 і FOX2, зв'язуючись з інтронів послідовністю, можуть пригнічувати формування комплексу E ', запобігаючи зв'язування SF1 з точкою розгалуження. [6]
Інгібітори сплайсингу можуть стерически заважати зв'язування активаторів з енхансером. Сімейство білків Hu / ELAV інгібує зв'язування U1, конкуруючи з білком TIA1, який взаємодіє з AU-багатою областю, розташованої далі по послідовності в 5'-сайті сплайсингу екзонів 23а нейрофіброматозного типу 1. [11] FOX1 і FOX2 також інгібують формування комплексу Е, зв'язуючись з екзонів послідовністю, близько розташованої від ESE, де зв'язуються TRA2 і SRp55. Через це U2AF не може закріпитися. [12]
Регуляція сплайсингу в залежності від позиції екзона
Дія цис-регуляторних елементів іноді залежить від позиції регульованого екзона. Кілька білків, наприклад такі як NOVA1, NOVA2, FOX1, FOX2, hnRNP l, hnRNP l-подібний, hnRNP F і hnRNP H, можуть діяти або як репрессори, або як активатори в залежності від місця сайту зв'язування. [13] [14] [15]
Позиція сплайсингу може визначати дію факторів сплайсингу. Енхансери можуть розташовуватися таким чином, що, коли фактори сплайсингу зв'язуються з ними, інший екзон краще розташований для дії сплайсосома. Або навпаки, елементи сайленсінг змагаються з компонентами сплайсосома або якось змінюють структуру мРНК, перешкоджаючи пізнанню сайту сплайсингу. [6]
Методи виявлення альтернативного сплайсингу
Основним методом визначення місць альтернативного сплайсингу в даний момент є секвенування бібліотек кДНК. отриманих на матриці мРНК. Даний метод називається секвенуванням РНК. Також можливе застосування ДНК-мікрочіпів.
Альтернативний сплайсинг та захворювання
Зміни в альтернативному сплайсинг можуть викликати різні захворювання: нейродегенеративні, серцево-судинні, дихальні захворювання, а також рак і хвороба Альцгеймера. У тканинах, де відбувається безліч процесів (наприклад головний мозок), потрібна велика кількість білків для виконання різних функцій. Будь дефект в альтернативному сплайсинг може різко змінити склад білків в клітині, внаслідок чого і виникнуть багато неврологічні захворювання. Ці дефекти можуть бути розділені на дві основні групи: первинні і вторинні дефекти сплайсингу.
Первинні дефекти сплайсингу
При первинних дефектах сплайсингу відбувається мутація в послідовності, яка важлива для правильного проходження альтернативного сплайсингу. Отже, сплайсинг не відбувається належним чином. Багато мутації, що призводять до захворювань, викликані порушеннями сплайсингу пре-мРНК. Прикладами є синдром Луї-Бара і нейрофіброматоз. Половина пацієнтів, які страждають цими захворюваннями, несе мутації, які впливають на проходження сплайсингу пре-мРНК. Інший приклад первинних порушень сплайсингу був виявлений у пацієнтів з лобно-скроневої деменції (аутосомно-домінантне розлад, пов'язаний з 17 хромосомою). Дефекти в сплайсинге призводять до зміни транскриптов тау-білків, асоційованих з мікротрубочками, - MAPT. Ці білки накопичуються в аксонах або зростаючих нейронах. Зміни в сплайсинге MAPT можуть також призвести до інших захворювань, таким як хвороба Альцгеймера. м'язова дистрофія, дисфункція глії і дегенерація спинного мозку. М'язова дистрофія Дюшенна (МДД) - це результат мутацій в гені дистрофина. Мутації викликають порушення в сплайсинге і продукцію неправильних мРНК. Різні мутації в пре-мРНК дистрофина викликають проміжний варіант МДД, м'язову дистрофію Беккера (МДБ).
Вторинні дефекти сплайсингу
Під вторинними дефектами сплайсингу маються на увазі мутації в регуляторних факторах, які дуже важливі для процесу сплайсингу. Дія різних активаторів і / або репрессоров може визначати шляхи проходження альтернативного сплайсингу. Залежно від того, який регулятор діє, пре-мРНК змінюється. У деяких випадках, це може привести до серйозних порушень. Прикладом таких порушень є Синдром Прадера-Віллі. генетична хвороба, що характеризується інтелектуальними і поведінковими відхиленнями.
Фермент ацетилхолінестеразою (AChE) збирається з серії білків. В ході альтернативного сплайсингу може виходити три ізоформи білка, які викликають такі нейродегенеративні захворювання, як хвороба Альцгеймера і хвороба Паркінсона. Розбалансування регуляторів сплайсингу може призводити до надлишку AChE-R, ізоформах AChE, знайденої у пацієнтів, які страждають на хворобу Альцгеймера. [1]