Алергія, діагностика алергії інгалляціонная алергія, алергічний риніт
Оцінка фагоцитарної ланки системи імунітету є невід'ємним елементом оцінки імунного статусу, який порушується при багатьох запально-інфекційних захворюваннях. Для оцінки фагоцитарної ланки системи імунітету використовують дослідження кількості і функціональної активності нейтрофілів (рідше моноцитів) крові.
визначають:- відсоток і загальне число, морфологію нейтрофілів крові
- поглинальну активність нейтрофілів з поглинання часток латексу, стафілококів, кандид
- обчислюють фагоцитарне число (середнє число поглинених часток)
- підраховують фагоцитарний індекс (відсоток нейтрофілів беруть участь в фагоцитозі)
- метаболічну активність нейтрофілів по відновленню нітросинім тетразолия (НСТ) в формазану
- хемотаксичних рухливість - за оцінкою рухливості до хемотаксичних речовини
- адгезивную активність - по прилипання до поверхонь, а також виявляють молекули адгезії за допомогою моноклональних антитіл
- оцінюють фенотип нейтрофілів - рецептори і CD-антигени
- визначають переваривающую активність (фагоцитарний киллинг).
Найважливішими серед цих показників є поглинальна і переваривающая активність нейтрофілів, так як вони прямо відображають їх протиінфекційні можливості. При використанні для оцінки перетравлює активності нейтрофілів бактерій важко досліджувати цю функцію. Основним методом оцінки перетравлення бактерій нейтрофилами є руйнування лейкоцитів, посів на живильне середовище і підрахунок виросли колоній бактерій. Інший метод - оцінка шляхом проточної цитометрії мічених бактерій або кандид. Хоча останній метод досить точний, але вимагає дорогої апаратури, недоступною більшості лабораторій.
Нами розроблений метод оцінки активності фагоцитарної ланки імунітету, а саме, поглотительной і перетравлює активності нейтрофілів.
Показання до застосування
Всі види іммунопатологіі. Первинні і вторинні імунодефіцитні хвороби, алергічні та автоімунні захворювання.
Імунологічний моніторинг населення, що проживає в екологічно несприятливих регіонах.
Контроль за імунотерапії захворювань, станом імунітету після протипухлинної хіміо і променевої терапії.
Розробка і проведення доклінічних і клінічних випробувань імуномодуляторів.
Перелік необхідного обладнання:
- Центрифуга (1000 об / хв).
- Камера Горяєва або Солар.
- Скляні центрифужні пробірки 10 мл (100 шт.).
- Термостат.
- Автоматичні дозатори 20 - 200 мкл.
- Мікроскоп з імерсійним збільшенням.
- Предметні скла (50 шт.)
- Фізіологічний розчин хлориду натрію на фосфатному буфері (ФСБ) рН 7,2 або розчин Хенкса.
- Культура Candida albicans. Метиленовийсиній. Азур. еозин
Опис технології використання методу
Підготовка Candida albicans
Готують робочу суспензію відмитих кандид (5.107 клітин в 1 мл). Оцінюють життєздатність кандид і використовують тільки суспензію містить не менше 96% живих Candida albicans. Для цього змішують 0,05 мл суспензії кандид і 0,1 мл фарби (суміш рівних обсягів 0,2% розчину водного еозину і 0,1% метиленового синього на дистильованої воді), через 10 хвилин суспензія клітин центрифугують при 1000 об / хв 10 хвилин на центрифузі ОПН-3, надосадову рідину відсмоктують, а з осаду роблять мазок, висушують і підраховують при світловій мікроскопії 200 кандид. Оцінюють відсоток живих, мають легке рожеве забарвлення і неживих, забарвлених синькою, дріжджових клітин.
Підготовка суспензії лейкоцитів хворого
Оцінка поглотительной активності нейтрофілів
Оцінюють фагоцитарний індекс (ФІ), фагоцитарне число (ФЧ) і киллинг в% убитих клітин через 30 і 60 хвилин інкубації. Всі проби дублюють. В кожну пробірку вносять 0,1 мл плазми досліджуваного пацієнта і додають 0,05 мл робочої суспензії кандид. Проби інкубують в термостаті 30 і 60 хвилин при 37 ° С. Потім суспензію клітин центрифугують 5 хвилин при 1000 об / хв, відсмоктують 0,05 мл надосадової рідини, осад акуратно ресуспензіруют і наносять 0,05 мл у вигляді краплі на край предметного скла. Потім відполірованим краєм другого предметного скла розмазують краплю по склу, роблячи тонкий мазок, висушують, фіксують спиртом і забарвлюють АЗУР-еозином (за Романовським) протягом 5-10 хвилин.
Обчислюють фагоцитарний індекс Гамбургера, для цього при світловій мікроскопії, під иммерсией підраховують відсоток фагоцитів мають поглинені кандиди.
Знаходять фагоцитарне число Райта (середнє число фагоцитованих кандид на один фагоцит): підраховують кількість кандид в цих фагоцитах і ділять на кількість цих фагоцитів. При дослідженні цих показників оцінюють 200 нейтрофілів.
Оцінка киллинга кандид нейтрофилами
До 0,05 мл суспензії клітин залишилися в пробірці додають 0,2 мл дистильованої води для лізису клітин крові. Потім, додають 0,5 мл фарби (суміш рівних обсягів 0,2% розчину водного еозину і 0,1% метиленового синього на дистильованої воді) для фарбування убитих фагоцитами кандид на 10 хв. Далі суспензія клітин центрифугують при 1000 об / хв 10 хвилин, надосадову рідину відсмоктують, а з осаду роблять мазок, висушують і підраховують при світловій мікроскопії відсоток убитих фагоцитами, забарвлених синькою, дріжджових клітин. Живі кандиди мають легке рожеве забарвлення. Оцінюють 200 кандид.
Дослідження двох показників фагоцитарної ланки системи імунітету у 30 здорових людей (донорів) показало, що після 30 хвилинної інкубації фагоцитарний індекс склав 74,6 + -10,3%; фагоцитарне число - 2,7 + -0,35; киллинг - 26,3 + -4,1%.
Відповідно до цього в нормі показники фагоцитарного ланки системи імунітету з використанням Candida albicans наступні:
- фагоцитарний індекс 65-85% (74,6 + -10,3%)
- фагоцитарне число 2,5-3,0 (2,7 + -0,35)
- киллинг 22-30% (26,3 + -4,1).
Дослідження цих показників в динаміці дозволяє оцінити швидкість лізису поглинених клітин. Підвищення фагоцитарного індексу і фагоцитарного числа при збереженому киллинга вказує на дефіцит перетравлення дріжджових клітин. Зменшення фагоцитарного індексу і фагоцитарного числа через 30 хвилин вказує на дефіцит поглинання. Зменшення фагоцитарного індексу і фагоцитарного числа може спостерігатися через 60 міну при інтенсивному лизисе дріжджових клітин.
Примітний факт високої точності пропонованого нами методу оцінки показників фагоцитарної ланки системи імунітету. При порівнянні результатів отриманих нашим методом (фагоцитарний індекс нейтрофілів цільної крові після 30 хвилинної інкубації 74,6 + -10,3%) і результатів з використанням проточного цитофлюориметрів (фагоцитарний індекс нейтрофілів цільної крові донорів після 30 хвилинної інкубації 75 + -10%) [ 4] зазначено абсолютне схожість.