Активність проліферації і ядерцевих організаторів клітин раку молочної залози як показник
на правах рукопису
Упорів Олександр Валерійович
АКТИВНІСТЬ ПРОЛІФЕРАЦІЇ І ЯДРШКОВИХ ОРГАНІЗАТОРІВ клітин раку молочної залози ЯК ПОКАЗНИК БIОЛОГIЧНОГО ПОВЕДІНКИ ПУХЛИНИ
14.00.15 - патологічна анатомія
Робота виконана в НДІ онкології ім.проф. Н.Н.Петрова Міністерства охорони здоров'я РФ; Харків
член-корр.РАЕН, доктор медичних наук, професор K.M.Пожарісскій
Науковий консультант: доктор медичних наук, професор В.Ф. Семіглазов
доктор медичних наук, професор Е.Л.Нейштадт доктор медичних наук Б.М.Аріель
Санкт-Петербурзька медична академія ім.І.І.Мечникова
З дисертацією можна ознайомитися у фундаментальній бібліотеці академії
доктор медичних наук
нення в тканину міченого попередника ДНК - близько ЮОмкм), що сильно відбивалося на результатах дослідження.
Таким чином, в даний час є комплекс методичес-, ких підходів для повноцінного вивчення пролиферативного статусу пухлини і пов'язаних з ним станів неопластичних клітин (сте-
1) вивчення активності проліферації і ЯО клітин РМЗ в зіставленні "з такими ж параметрами доброякісних пухлин і непухлинних уражень молочної залози.
2) порівняльне вивчення активності проліферації і ЯО в первинному РМЗ, його рецидивах і метастазах в регіонарні лімфатичні вузли.
4) визначення частки клітин РМЗ, що знаходяться у фазі синтезу ДНК і митозе і відповідно відносної тривалості цих фаз мітотичного циклу
5) визначення взаємини між активністю проліферації і ЯО в пухлинах молочної залози
6) порівняльне вивчення ПА пухлин з використанням різних маркерів проліферації з метою вибору найбільш інформативного і найбільш оптимального для широкого використання в онкоморфоло-ня дослідженнях.
Основні положення, що виносяться ва захист
1) Одночасне використання трьох маркерів проліферації (БДУ,
ЯАПК і антигену К1-67), що відображають різні фази МЦ, дає можливість визначити індекс Б-фази і величину пролиферативного пулу пухлини, а також оцінити частку клітин, що знаходяться в З-фазі і митозе і відповідно відносну тривалість цих фаз.
2) Показники проліферації при трьох використаних нами маркерах характеризуються високою (г - 0,73 - 0,94) прямий достовірної кореляцією.
3) Показники ПА РМЗ в 5 разів ВШЕ, ніж в доброякісних утвореннях і достовірно збільшуються в рецидивних пухлинах і в міру наростання ступеня гістологічної злоякісності новоутворення. ^
4) Між ПА первинного РМЗ і такий його метастазів в регіонарні лімфатичні вузли є достовірна пряма кореляція,
але в більшості випадків показники проліферації в метастазах нижче, ніж в первинних пухлинах.
5) В РМЗ S-фаза - найтриваліша фаза МЦ, що займає близько 45% його, на частку мітозу припадає близько 5% часу. У міру наростання ПА РМЗ відбувається збільшення відносної тривалості мітозу, відносна тривалість S-фази залишається постійною.
Научвая Вотава. Вперше проведено комплексне дослідження ПА, що оцінюється за інкорпорації БДУ в ДНК ядер пухлинних клітин при його введенні хворим, за експресією ЯАПК і Ki-67, і активності ЯО в РМЗ. Взявши за основу • визначення ПА пухлини методику з інкорпоруванням БДУ в ядерну ДНК при її реплікації in vivo, що відрізняється точністю експерименту, в зіставленні з про-діфератівнимі показниками, встановленими двома іншими способами, вдалося показати достовірну високу пряму кореляцію між усіма вивченими маркерами проліферації. Використання трьох маркерів проліферації, що відображають метаболічні події, що відбуваються в різних фазах МЦ, дало можливість отримати індекс S-фази і величину пролиферативного пулу РМЗ, а також оцінити частку клітин, що знаходяться в фазі синтезу ДНК і-митозе і відносну тривалість цих періодів МЦ.
Зіставлення ПА пухлин з їх клініко-морфологічними особливостями призвело до встановлення нових фактів. Так, показано, що рецидивні пухлини характеризуються більш високою проліферацією клітин, ніж первинні пухлини, а в метастазах вона, навпаки, знижена в порівнянні з первинними РМЗ, хоча між їх проліфера-нормативними показниками зберігається прямий кореляційний зв'язок. ПА ІПР інтенсифікується в міру наростання ступеня гістологічної злоякісності новоутворення. При етом'она пов'язана з порушенням гістотіпіческой диференціювання пухлини і не відображає цитологічного і ядерного атипизма і поліморфізму, (цітотіпіческой диференціювання).
У даній роботі, встановлено, що тривалість мітозу, яка в середньому займає близько 5% тривалості МЦ, увеличи-
ється в зв'язку з наростанням ПА; в той же час тривалість Б-фази, що займає близько половини МЦ, виявляється величиною постійною, що не змінюється в залежності від кількості, проліферуючих клітин.
Активність ЯО чітко корелює з вивченими нами показниками проліферації і є цінною характеристикою структурних і функціональних особливостей пухлини.
Практтеская значимість. Показано значення визначення активності проліферації і ЯО в оцінці ступеня злоякісності РМЗ. Для оцінки ПА пухлин найбільш оптимальним є визначення експресії антигену К1-67. По-перше, вона відображає найбільш важливий показник репродукції клітин - проліферативний пул новоутворення. По-друге, використання цього способу не потребує будь-яких попередніх впливів на хворого і дає можливість отримувати повноцінні результати при дослідженні архівного матеріалу у вигляді парафінових блоків. По-третє, при цьому способі спостерігається виразна, високо селективна забарвлення проліферуючих клітин і їх підрахунок не викликає ускладнень.
Активність ЯО є важливою характеристикою поведінки пухлини, так як служить показником інтенсивності рибосомального синтезу і, чітко корелюючи з показниками ПА, може бути додатковим параметром оцінки репродуктивної здатності пухлинних клітин. До того ж простота визначення активності ЯО дає можливість використовувати її в патологоанатомічних лабораторіях і відділеннях, які не требуя'спеціального оснащення.
У дисертації подано численні методичні рекомендації щодо використання способів визначення ПА і активності ЯО в онко-морфології.
Сгарумяура і обсяг дисертації. Дисертація викладена на 208 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методик, результатів власного дослідження, обговорення отриманих результатів, висновків і списку використаних джерел. Робота містить 31 таблицю, 24 графіка і 19 мікрофотографій. Бібліографічний покажчик включає 289 літературних джерел.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИКИ
Було вивчено 58 пухлин молочної залози (10 доброякісних пухлин, 48 PME, 41 з яких составіл.ІПР) і 15 метастазів цих пухлин в регіонарні лімфатичні вузли.
Для визначення індексу проліферації (ЙП) по включенню БДУ в ядра клітин in vivo приблизно за 1 год. до видалення пухлини хворим вводили внутрішньовенно ця речовина в дозі 200мг / м2 поверхні тіла у фізіологічному розчині (використання БДУ в клінічній роботі дозволено Фармакологічним комітетом Минздравмедпрома РФ). Інкорпорований БДУ визначали в парафінових зрізах непрямим імунопероксидазному методом за допомогою моноклональних мишачих антитіл до галогеновані уридин IU-4 (Caltag lab. San Francisco, CA, USA) в розведенні 1: 250 після денатурації ДНК в розчині -2Н соляної кислоти.
■■■ ■■ - 8 - '• ЯАПК виявляли в парафінових зрізах непрямим іммунолероксідаз-ним методом за допомогою моноклональних мишачих-антитіл РС10 (DAKO, Данія) у розведенні 1: 100. Застосовували два способи підрахунку: 1) враховували всі клітини, зкспрессірущіе ЯАПК, 2) реєстрували тільки клітини з інтенсивної експресією антигену.
Антиген Ki-67 визначали в парафінових зрізах непрямим имму-нопероксідазним методом за допомогою поліклональних кролячих антитіл до людського антигену Ki-67 (DAKO, Данія) у розведенні 1: 200 після демаскування антигену кип'ятінням зрізів в скороварці в цитратному буфері.
ПА клітин визначали при підрахунку 1000-150Ö клітин і Ш1 висловлювали у відсотках. Крім того, виробляли підрахунок митотических фігур серед Ki-67-позитивних клітин (МІТ) і результати виражали в процентах.
Відносну тривалість S-фази. Щ виробляли за формулою Sasaki К. і співавт. (1988):
ІП БДУ відносна тривалість S-фази х 1OOZ
ІП Ki-67 відносна тривалість МЦ Відносну тривалість мітозу виробляли за формулою: МІТ __ відносна тривалість мітозу х 100% ІП Ki-67 - • відносна тривалість МЦ аргентофільних кислі білки, пов'язані з зонами ЯО, фарбували за способом WMHowell і DABlack (1980 ) в модифікації HHМамаева і співавт. (1984). Підраховували число ядерець і зерен срібла всередині ядерець і в кариоплазме в 1! 00-150 ядрах клітин пухлин.
РЕЗУЛЬТАТИ І ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Отримані нами дані з використанням 3 "різних маркерів клітинної проліферації показують, що ПА клітин PMS приблизно в 5 разів вища за таку доброякісних пухлин (табл.1). Наше спостереження підтверджує літературні дані (Lelle RJ і співавт., 1987; Dervan PA і співавт. ; Wintzer Н.-о. і співавт.). Однак звертає на себе увагу великий розкид значень ПА клітин РМЗ від низьких значень, що не перевищують таку доброякісних пухлин, до дуже високих значень, рівних 65-68% клітинної по- 'пуляціях. Дане спостереження підкреслює різко виражену гетеро генность РМЗ, яку слід враховувати при визначенні прогнозу
Таблиця 1. Пролиферативная активність клітин пухлин молочної залози.
Маркер Індекс Тест Манна-Уїтні,
проліферації проліферацііД р
Включення ЄдУ 1,97 (0,80 - 4,90) 10,95 (2,20 - 26,90) 0,000002
Експресія ЯАПК: -загальна 30,11 (11,57 - 54,78) • 44,87 (23,19 - 67,58) 0,005
-інтенсивна 6,21 (1,08 - 13,79) 25,71 (7,50 - 53,70) 0,000003
Експресія К1-67 4,75 (1,60 - 11,76) 24,89 (8,64 - 65,16) 0,000001
Таблиця 2. Пролиферативная активність інвазивного протокового раку молочної залози в залежності від СГЗ пухлини.
Показник ІП (БДУ); р. ІЩЯАПКобщ); р ІП (ЯАПКінт); р Іщ К1-67); р
Ступінь гістологічної злоякісності: I 6,08% II 9,60% III 15,27% 0,0001 35,54% 50,86% 50,31% 0,001 15,21% 29,08% 34,19% 0,0001 14,27% 22,18% 36,11% 0,00001
Здатність до утворення тубулярних структур: висока-середня -низька 6,32% 7,91% 14,00% 0,002 - 36,66% 38,86% 50,93% 0,002. 15,06% 19,44% 33,52% 0,0001. 13,89% 18,15% 33,40% 0,0004
Мітотична активність; -низька-середня-висока 5,95% 9,53% 15,60% 0,0001 36,66% 48,68% 51,02% 0,0005 15,61% 27,69% 35,49% 0, 0003 14,82% 23,64% 34,81% 0,0002
Ядерні атипия тн поліморфізм: -низькі -середні -високі 5,82% 11,45% 11,54% 0,34 32,83% 46,19% 47,56% 0,04 14,13% 27,88% 27 , 94% 0,04 13,24% 26,29% 28,40% 0,05
Примітка: У таблиці наведені середні значення показників ПА. р-Медіанний тест.
Нами також не виявлено залежності між ПА клітин FMI і наявністю метастатичних уражених регіонарних лімфовузлів (р-0,2 для ЄдУ і р-0,2 для Ki-67; тест Манна-Уїтні). Такі ж результати отримані іншими дослідниками (Ashton-Key M. і співавт .; Pinder S.E. і співавт .; Pietilainen Т. і співавт.). Ймовірно, на метастазування FWffi більш сильний вплив надають інші чинники, такі як зміни клітинної адгезії, стан позаклітинного матриксу (Pietilainen Т. і співавт.), Ферментні клітинні фактори інвазії, активність неоангіогенезу і другіе►
За нашими даними, немає залежності між ПА клітин РМЗ і інва-зівной потенціями пухлини.
Показники ПА пухлин молочної залози, визначені за допомогою 3 маркерів проліферації, мали високу ступінь кореляції (табл.3). З одного боку, це робить більш обґрунтованими виявлені нами закономірності. З іншого боку, висока кореляція між показниками, що відображають різні фази МЦ, дозволяє зробити висновок про проходження раковими клітинами фаз МЦ без блоку в будь-яких з них.
Отримана нами відносна тривалість S-фази клітин FMK, рівна 44,64 (24,40 - 89,21)% МЦ, в загальному близька до результатів K.Sasaki і співавт. (1988) - 0,58 + 0,28. За нашими даними, відносна тривалість мітозу клітин РМЯ дорівнює 5,04 (1,00 -11,20)% МЦ. При цьому ми виявили, що відносна тривалість мітозу достовірно наростає зі збільшенням ПА клітин при збереженні постійної тривалості S-фази. Це може означати: 1) затримку клітини в мітозі ', або 2) пропорційне скорочення Si
S і 02-фаз при збереженні тривалості мітозу (McGurrin J.F. й співавт. 1987). Літературні дані з цього питання мізерні і суперечливі. З огляду на дані І.А.Алова (1972), можна припустити, що відбувається справжнє подовження мітозу за рахунок затримки пухлинних клітин в метафазі внаслідок поломки тіолового механізму клітинного ділення.
За нашими даними, значення всіх показників активності ЯО, за о- винятком кількості ядерець, в клітинах РШ достовірно вище, ніж в клітинах доброякісних утворень (табл.4), що відповідає даним інших aBTopoB (Smith І.І Crocker J.; Dervan PA І співавт.). Однак перекривання значень кількості гранул срібла в доброякісних і злоякісних пухлинах не дає можливості використовувати показник активності ЯО як абсолютного критерію для диференціальної діагностики цих новоутворень.
Кількість внутрядришкових гранул і загальна кількість гранул срібла в ядрі знаходиться в тих же наших взаємовідносинах із СГЗ ІПР і клініко-анатомічними особливостями РШ, що і всі показники
Таблиця 3. Коефіцієнти кореляції між показниками проліферації клітин ШЖ при використанні різних маркерів (Тест рангової кореляції Спірмёна, г).